제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화
Summary
이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.
Abstract
Zebrafish는 초기 개발 중에 선천적 면역 체계에 전적으로 의존하여 투명한 자연과 의존성으로 인해 선천적 면역 세포 행동을 연구하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 제브라피쉬 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)감염 모델은 진균 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하는 데 잘 확립되어 있다. 다른 대식세포 사멸 유형이 진균 감염의 다양한 결과로 이어질 것이라는 것이 제안되었다. 여기에서 우리는 M. marinum 감염 다음 zebrafish 태아에 있는 대식세포 세포 죽음을 관찰하기 위하여 intravital 현미경 검사를 사용하여 프로토콜을 기술합니다. 특히 대식세포와 호중구에 라벨을 붙이는 Zebrafish 형질전환 선은 중뇌 또는 트렁크에 형광으로 표지된 M. marinum의 근육 내 미세 주입을 통해 감염됩니다. 감염된 제브라피시 배아는 이후에 낮은 용융 아가로오스에 장착되고 X-Y-Z-T 치수에서 공초점 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 장기 라이브 이미징은 광표백 및 광독성을 피하기 위해 낮은 레이저 파워를 사용해야 하기 때문에 형질전환이 강력히 권장됩니다. 이 프로토콜은 면역 세포 이동, 숙주 병원체 상호 작용 및 세포 사멸을 포함하는 생체 내 동적 프로세스의 시각화를 용이하게 합니다.
Introduction
마이코박테리아 감염은 숙주 면역세포 사멸을 유발하는 것으로 입증되었다1. 예를 들면, 감쇠한 긴장은 대식세포에 있는 세포자멸을 시작하고 감염을 포함할 것입니다. 그러나, 악성 긴장은 세균성보급을일으키는 원인이 되는 lytic 세포 죽음을 시작할 것입니다1,2. 세포 죽음의 이 다른 모형이 호스트 항 진균 반응에 있는 충격을 고려하면, 생체 내에서 진균 감염 도중 대식세포 세포 죽음의 상세한 관측이 필요합니다.
세포 사멸을 측정하는 종래의 방법은 안네신 V, TUNEL, 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색3,4,5와같은 죽은 세포 얼룩을 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 생체 내에서 세포 사멸의 동적 과정에 빛을 비출 수 없습니다. 시험관내 세포 사멸의 관찰은 이미 살아있는 화상 진찰6에의해 촉진되었습니다. 그러나, 결과 정확 하 게 생리 조건을 모방 여부 불분명 남아.
Zebrafish는 호스트 항 진균 반응을 연구하기위한 훌륭한 모델이었습니다. 그것은 인간과 유사한 높게 보존된 면역 계통을, 쉽게 조작한 게놈, 및 초기 태아는 살아있는 화상진찰7,8,9를허용하는 투명합니다. M. marinum에 감염 후, 성인 얼룩말 은 전형적인 성숙한 육아종 구조를 형성하고, 배아 제브라피쉬는 구조9,10과같은 초기 육아종을 형성한다. 선천성 면역세포-박테리아 상호작용의 역동적인 과정은 제브라피쉬 M. 마리눔 감염 모델11,12에서이전에 탐구되었다. 그러나, 높은 공간 시간적 해상도 요구 사항으로 인해, 타고난 면역 세포의 죽음을 둘러싼 세부 사항은 크게 정의되지 않은 남아있다.
여기에서 우리는 생체 내에서 진균 감염에 의해 유발된 대식세포 리선세포 사멸의 과정을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 발달 및 염증 동안 생체 내에서 세포 행동을 시각화에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 균균 감염 중 대식세포 죽음의 시각화를 설명합니다. 세포막의 무결성 등의 요인에 기초하여, 감염 구동 세포 사멸은 세포사멸과 사멸세포사멸(24,25)으로나눌 수 있다. 용리세포 사멸은 세포사멸보다 유기체에 더 스트레스가 많으며, 강한 염증 반응을 유발하기 때문에 24,25. 생체 내에서 용액 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
지롱 웬 박사님, 스테판 올러스 박사, 데이비드 토빈 박사님이 M. marinum 관련 자원을 공유해 주신 데 대해 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81801977) (B.Y.), 상하이 시 보건위원회의 뛰어난 청소년 교육 프로그램 (2018YQ54) (B.Y.), 상하이 항해 프로그램 (18YF1420400) (B.Y.), 그리고 상하이 키 연구소의 오픈 펀드 (B.Y.) (B.Y.) 및 상하이 키 연구소 (B.Y.) (B.Y.) (B.Y.) 및 오픈 펀드 (B.Y.)
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
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