이 프로토콜은 16S rRNA에 의한 환자 생검에서 조직 관련 박테리아의 편견 없는 검출을 위한 것으로, 공초점 현미경 검사법에서.
호스트 점막 표면 및 조직과 박테리아의 상호 작용의 시각화는 병인의 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 감염의 동물 모형에 있는 세균성 병원체의 가시화는 GFP와 같은 형광성 단백질을 표현하기 위하여 설계된 세균성 긴장에 의지할 수 있는 동안, 인간 적인 환자에게서 얻은 생검 또는 조직의 점막 내의 박테리아의 가시화는 요구됩니다 편견없는 방법. 여기에서, 우리는 인간 생검 단면도에 있는 조직 관련 박테리아의 검출을 위한 능률적인 방법을 기술합니다. 이 방법은 재발성 으로 고통받는 환자에서 취득 한 방광 생검 섹션 내의 조직 관련 박테리아를 라벨에 16S rRNA에 대한 형광 표지 보편적 인 올리고 뉴클레오티드 프로브와 함께 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 이용합니다. 요로 감염. 범용 16S rRNA 프로브를 사용하여 면역형광 실험에 의해 검출에 필요한 종, 제네라 또는 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 생화학적 특성에 대한 사전 지식 없이 박테리아를 검출할 수 있습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 의하여 화상 진찰에 생검 고정에서 16S rRNA 물고기를 위한 완전한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 거의 모든 유형의 조직에서 사용하도록 적응될 수 있으며 환자 조직에서 임상적으로 관련된 세균 숙주 상호 작용의 편견 없는 시각화를 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 더욱이, 종 또는 제네라 특이적 프로브를 사용하여, 이 프로토콜은 환자 조직 내의 특정 세균성 병원체의 검출을 위해 적응될 수 있다.
요도로 구성된 요로, 방광, 요관 및 신장은 요로에서 비뇨생식기 대장균 (UPEC)과 같은 요로 미생물군유전체뿐만 아니라 비뇨생식기 균을 침입하는 박테리아에 지속적으로 노출됩니다. 1,2. 글리코사미노글리칸으로 구성된 수화 점액층과 표면 세포 표면에 발현된 당화 로플라킨 단백질의 불투과성 플라크는 부착물의 침입으로부터 방광 상피를 일상적으로 보호하는 장벽을 형성합니다. 박테리아3,4. 요로 감염(UTI) 동안, 이러한 장벽은 방해되거나 파괴되어, 비뇨생식기 균5,6에의한 방광 상피의 부착 및 침입을 용이하게 한다. 뮤린 모델에서 의약연구는 UPEC, Klebsiella 폐렴,및 엔테로코커스 대변을 포함한 많은 비뇨생식기 균이 피상세포의 세포질 내에서 복제세포 내 커뮤니티(IBC)를 형성할 수 있다는 것을 밝혀내고, 과도상 피세포내의 정지성 세포 내 저장소 (QIRs)7,8,9. UPEC는 인간 UTI 환자에게서 창피 상피 세포 내에서 확인되었지만, 인간에 있는 방광 점막과 비뇨기과균의 상호 작용은 이전에10을구상하지 않았습니다.
우리는 일반적인 기술을 적응, situ 혼성화에 형광 (FISH), 첨단에 대한 삼조염의 전분화와 방광경검사를 받고 폐경 후 환자에서 얻은 방광 생검의 점막 내의 박테리아를 검출하기 위해 (CEFT) 항생제 내화성 재발 성 요로감염의 관리 11. 16S rRNA를 위한 보편적인 탐사기를 사용하여, 우리는 재발하는 UTI 환자의 방광 점막과 관련되었던 세균성 종을 객관적으로 검출하고 방광 벽12내의 그들의 위치를 결정할 수 있었습니다. 보편적 인 16S rRNA 뉴클레오티드 프로브는 이전에 대장균 16s rRNA의 위치 388-355에 해당하는 세균 16S rRNA13의보존 된 영역을 대상으로 설계되었습니다. 16S rRNA 및 스크램블 프로브 서열은 마우스 위장관14,15에사용하기 위해 이전에 검증되고 출판되었다. 프로브의 서열 및 특성은 표 1에설명되어 있습니다. 방광 상피, 콜라겐 및 엘라스틴 이형 16을 나타내기 때문에 실제 신호와 배경 신호를 구별할 수 있도록 이 프로토콜에서 두 개의 순차적 절편을 사용하는 것이 필수적입니다. . 이 프로토콜에서, 16S rRNA 및 스크램블 프로브는 형광 신호를 증가시키기 위해 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테르 연계를 통해 3′ 및 5′ 테르미니 모두에 형광 알렉사 플루오르 488 라벨로 설계되었습니다.
이 프로토콜은 인간의 방광 생검 섹션에 사용하기 위해 개발되었지만, 박테리아가 상주하는 것으로 추정되는 모든 조직에서 파라핀 내장 섹션에 사용하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다. 세균 표면에 특정 항원 (예를 들어, 리포폴리사카라이드)을 표적으로 하는 면역 조직 화학 실험과는 달리,이 방법은 조직 관련박테리아에의해 발현된 항원10,17에 의해 발현된 항원에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다. . 보편적 인 16S rRNA 프로브의 사용은 샘플 내에서 모든 세균 종의 편견 검출을 허용하지만, 자신의 정체성의 결정을 허용하지 않습니다. 검출된 박테리아, 종 또는 속 특이적 16S 또는 23S rRNA 프로브의 식별을 확인하려면 반드시 사용해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 칸디다 알비칸스와같은 곰팡이 병원균을 검출하지 않습니다, 숙주 조직과 관련되었던. 곰팡이 병원균의 검출을 위해, 28S 또는 18S rRNA 프로브는18를사용해야합니다.
여기서, 우리는 16S rRNA FlSH에 의한 인간 방광 생검에서 조직 관련 박테리아의 검출을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 위장관 또는 피부와 같은 다른 조직에서 채취한 생검에 쉽게 적응할 수 있으며 다양한 포유류 모델 유기체로부터 수확된 조직으로 확장될 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 또한 다중 고정(예를 들어, 포르말린, 에탄올, 메타칸) 및 조직 제제 기술(예를 들어, 파라핀 또는 수지 내장, 및 저온 보존 조직)의 사용을 위해 적응될 수 있다. 이중 표지된 범용 16S rRNA 프로브는 조직 내에 존재하는 모든 세균 종의 편견 없는 검출을 허용하며 병원균과 미생물이 질병과 건강한 점막 표면과 공간적으로 상호 작용하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 상태. 종 또는 제네라 특이적 16S 또는 23S rRNA 프로브의 선택 또는 설계를 위한 ARB 소프트웨어 패키지의 probeBase, PhylOPDb 또는 PROBE_DESIGN 도구와 같은 리소스를 사용하여 이 프로토콜은 특정 세균 종 또는 제네라의 검출을 위해 조정될 수 있습니다. 조직내 15,21,22. 이 방법에 대한 중요한 미래 방향은 방광 점막 내의 미생물 다양성의 평가를 위해 다른, 이산 플루오로포로 표지된 종 또는 제네라 특이적 프로브를 사용하여 다방산하는 것입니다.
인간 견본에 사용하기 위한 이 방법의 1 차적인 제한은 생검한 조직의 가용성입니다. 최적의 샘플 수집 및 환자 메타데이터에 대한 액세스를 위해 절차를 수행하는 임상의와의 직접 적인 협력을 위해 기관 검토 위원회 승인 및 통보된 환자 동의가 요구됩니다. CEFT 절차 자체는 방광 상피를 파괴하기 때문에 우리는 절차 의 앞에 이 지역의 생검을 정당화할 수 있었습니다. 탈파라핀화 단계에서 독성 자일렌을 사용하고 시술 전반에 걸쳐 멸균 환경을 유지해야 하기 때문에 이 프로토콜에 대해 연기 후드 또는 적절하게 장착된 생체 안전성 캐비닛이 요구된다. 이 프로토콜에는 Hoechst, Alexa-555 및 Alexa-488의 시각화를 위한 63x 또는 100x 객관적이고 적절한 필터 세트를 갖춘 형광 현미경, 바람직하게는 공초점이 필요합니다. 도 1에 도시된 대표적인 결과는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 유사한 레이저 스캐닝 현미경은 유사한 이미지를 생성해야 합니다. 이 프로토콜은 조직 관련 박테리아만 을 검출하는 능력에 의해 제한되며, 예를 들어 곰팡이가 아닙니다. 진균 18S 또는 28S rRNA를 특이적 프로브는 조직18내의 곰팡이 병원체를 식별하기 위해 사용되어야 합니다.
이 프로토콜에 대한 중요한 단계는 절차 전반에 걸쳐 멸균 환경을 유지하고 조직이 혼성화 및 염색 단계 사이에 건조되지 않도록 하는 것을 포함합니다. 시술 도중 조직이 마르면 신호가 약해질 수 있으며, 세척 단계 동안 조직이 슬라이드에서 떨어질 수 있습니다. 또한 이 프로토콜에 대해 항상 두 개의 직렬 섹션을 사용하는 것이 중요합니다(하나는 16S rRNA 프로브용이고 다른 하나는 스크램블 프로브용). 이러한 제어가 없으면 거짓 긍정을 구별하기가 매우 어려울 수 있으며 얻은 데이터는 유용하거나 유익하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜이 범용 16S rRNA 프로브 이외의 프로브와 함께 사용하도록 적응되는 경우, 프로브의 예측된 용융 온도보다 약 5°C 낮은 적절한 혼성화 온도를 선택하도록 주의를 기울여야 합니다. 신호 강도를 유지하기 위해, 조직은 프로브가 추가 된 후 오랜 시간 동안 빛에 노출되어서는 안되며 현미경 검사법 중에 과다 노출되어서는 안됩니다. 마지막으로, 현미경 검사 법 동안 물고기 프로브에 공액된 형광공에 대응하는 채널에 대해 동일한 설정은 실험(16S rRNA 프로브)과 제어(scramble probe) 슬라이드 사이에 일관되게 유지되어야 한다. 환자 유래 조직의 점막 표면 내의 박테리아의 공간 적 관계를 시각화하는 것은 감염성 질병의 근본적인 호스트 병원체 상호 작용에 대한 임상적으로 관련된 가설을 이해하고 구축하는 데 중요합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프로토콜 조언과 기술 지원에 대한 아만다 아루트김 오스와 마르셀 라 드 수자 산토스에게 감사드립니다. 이 작품은 K.P가 개최한 시스템 생물학 과학의 세실 H. 및 이다 그린 의자에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |