Rilevamento di batteri residenti nei tessuti nelle biopsie della vescica mediante 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Il protocollo di studio è stato approvato e seguito dalle linee guida dei Comitati di Biosicurezza Istituzionale e Sicurezza Chimica di UT Dallas e UT Southwestern Medical Center. L’uso di biopsie da soggetti umani in questo protocollo è stato approvato e seguito le linee guida dei comitati di revisione istituzionale dell’UT Dallas e dell’UT Southwestern Medical Center. Tutte le persone coinvolte nella raccolta e nell’elaborazione della biopsia hanno l’attuale formazione sulla protezione del soggetto umano (HSP) e sulla formazione HIPPA. 1. Preparazione dei tessuti per la fissazione e l’incorporamento della paraffina NOT:</ Le biopsie sono state prese da donne consenzienti sottoposte a cistoscopia con elettrogurazione della trigonite per la gestione avanzata dell’infezione ricorrente delle vie urinarie (rUTI). rUTI è definito come 3 UTI in un periodo di 12 mesi. La raccolta della biopsia è stata eseguita in sala operatoria mentre il paziente era in anestesia dopo aver ottenuto il consenso del paziente informato per protocollo UTSW IRB STU 082010-016. Tutti i campioni sono stati codificati e de-identificati prima della sperimentazione. Ottenere una biopsia atazza fredda dalla vescica trigone con pinze urologiche tramite cistoscopio flessibile e mettere immediatamente in uno sterile crioviale da 2 mL contenente 1,5 mL del 4% v/v paraformaldedeide (PFA) preparato in 1x sterile fosfato buffer (PBS).NOTA: il 4% di PFA in 1x PBS può essere effettuato in anticipo e conservato a -20 gradi centigradi fino a quando necessario. Fissare la biopsia per 6 h a temperatura ambiente o per 16-24 h a 4 gradi centigradi. NOT:</ La durata della fissazione deve essere calcolata in base alle dimensioni del campione di tessuto e si dovrebbe evitare la fissazione eccessiva. Non è consigliabile utilizzare glutaraldeide come fissativo in quanto introduce l’autofluorescenza. In un cappuccio sterilizzato o in un armadietto di biosicurezza, rimuovere il fissativo con il pipettaggio e sostituirlo con 1,5 mL di sterile 1x PBS. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi o eseguire immediatamente l’elaborazione dei tessuti e l’incorporamento della paraffina19. Utilizzare un microtoma sterilizzato per sezionare blocchi di tessuto a 5 m di spessore e aderire sezioni di tessuto di paraffina ai vetrini del microscopio di vetro caricati. Per il protocollo 16S rRNA FISH saranno necessari almeno due vetrini per biopsia. NOT:</ Il tessuto della biopsia deve essere disposto in sezione rispetto al piano di taglio al fine di garantire la visualizzazione degli strati uroteliali in tutte le sezioni. Va anche notato che lo spessore della sezione dovrebbe essere ottimizzato per il rilevamento della comunità batterica. Possono essere necessarie sezioni più sottili o campionamento di più sezioni seriali nel caso di infezioni in cui i batteri residenti nei tessuti sono estremamente scarsi (ad esempio, il batterio residente nei tessuti <1 per 1.000 cellule di mammiferi). 2. Fluorescenza nell’ibridazione situ con sonde rRNA Universal 16S NOT:</ Sono necessari due vetrini per biopsia. Una diapositiva è necessaria per la sonda rRNA universale 16S e una diapositiva per una sonda di controllo con una sequenza strapazzata. Questo è importante per distinguere il segnale vero dal segnale di fondo durante la microscopia poiché l’epitelio della vescica è auto-fluorescente in più canali. Oltre alla sonda scramble, il blocco con 0,1% Sudan Black B prima del montaggio può ridurre l’autofluorescenza dello sfondo inerente al tessuto20. Preparazione di reagenti e cappa di fumi Pulire un cofano di fume vuoto (o un armadio di biosicurezza opportunamente montato) con 70% di etanolo. Preparare il buffer di ibridazione composto da 0,9 M di cloruro di sodio (NaCl), 20 mM MM Tris-HCl (pH 7.2), 0,1% solfato di solfato di solfato di sodio dodecyl (SDS) in 10 mL di acqua filtrata sterile. NOT:</ L’acqua filtrata sterile può essere preparata passando l’acqua distillata autoclaved attraverso un filtro da 0,22 M. Il buffer di ibridazione può essere memorizzato a temperatura ambiente, ma l’SDS può precipitare dalla soluzione. Se l’SDS precipita, scaldare la soluzione in un bagno d’acqua a 50 gradi centigradi prima dell’uso. Preparare almeno 100 mL ciascuno del 95% e del 90% di etanolo in acqua sterile filtrata in bottiglie lavate e autoclaved. Sciogliere le sonde liofilizzate fluorescenti in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 1 mM di acido etilenediaminetratratico (TE) preparato in acqua priva di nucleato sterilizzata a un’umidità finale di 100 m. Preparare una diluizione di 1 M nel buffer TE per l’uso in questo protocollo. Conservare sia 100 M di stock concentrato sia 1 sonde ricostituite a -20 gradi protetti dalla luce. NOT:</ Non sciogliere le sonde etichettate fluorescentmente in acqua. Il buffering è necessario per prevenire l’idrolisi del legame dell’estere NHS che coniuga il fluoroforo alla sonda di nucleotide. Pulire cinque vasetti Coplin con 70% etanolo, lasciare asciugare, etichettare come segue: xylenes I, xylenes II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, e riempire con 100 mL della soluzione appropriata. Ciò consentirà di evitare confusione nei passaggi successivi. Deperaffinazione e reidratazione dei tessuti Nel cofano, posizionare due vetrini per biopsia in un rack di diapositive verticale. Inserire un portante verticale nel barattolo di xilene I Coplin (contenente 100 mL di xilene) per 10 min. Rimuovere il portante dagli xileni I e macchiare il fondo su un tovagliolo di carta per rimuovere gli xylene in eccesso. Mettere nel barattolo di xilenes II Coplin per 10 min. NOT:</ Non lavorare mai con gli xileni al di fuori di una cappa di fumi certificata. Reidratare le sezioni di tessuto disperaffinato in successivi otanoli (95% e 90%) per 10 min ciascuno nei vasetti Coplin rispettivamente etichettati. NOT:</ Durante questa fase, il buffer di ibridazione caldo a 50-56 gradi centigradi in un bagno d’acqua Togliere il rack scorrevole dal 90% di etanolo, macchiare il fondo sugli asciugamani di carta per rimuovere l’etanolo in eccesso e mettere nel barattolo ddH2O Coplin contenente 100 mL di ddH2 O sterilizzati a filtro per 10 min. In attesa del lavaggio ddH2O, diluire le sonde a 10 nM nel buffer di ibridazione per creare la soluzione di colorazione. Preparare 150 l di soluzione di colorazione per diapositiva. NOT:</ Proteggere la soluzione di colorazione dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio e conservandolo in un cassetto. Quando si lavora con sonde con etichetta fluorescente sul piano della panca, è consigliabile spegnere le luci aeree quando possibile. Le sonde diluite nel buffer di ibridazione non devono essere riutilizzate. Ibridazione e contro-colorazione Preparare una camera umida per ogni sonda posizionando Kimwipe imbevuto e accartocciato e acqua sterile al serbatoio di una scatola di punta P1000. Posizionare la cartuccia del portapunta in alto – questo è dove sisiedi i vetrini. NOT:</ È importante utilizzare una camera umidificante per evitare che le sezioni di biopsia si secchino durante l’ibridazione. Va notato che le camere umide disponibili in commercio sono progettate per mantenere un’atmosfera stabile e umida. Tuttavia, la tecnica qui descritta controlla sufficientemente l’umidità a costi notevolmente inferiori. Rimuovere i vetrini dal rack scorrevole e posizionare su un tovagliolo di carta fresca (tessuto-side up). Utilizzare un Kimwipe per asciugare la diapositiva. Fare attenzione a tamponare delicatamente solo vicino (non su) la sezione biopsia per stoppino via l’acqua. Utilizzando una penna idrofobica, disegnare un bordo intorno alla sezione biopsia e posizionare il velo a lato superiore nella camera umidificante. NOT:</ Lavorare rapidamente in modo che i tessuti non si asciughino prima dell’ibridazione. Collocare la camera umidante in un’incubatrice impostata a 50 gradi centigradi. Pipetta 50-150 -L della soluzione di colorazione direttamente sopra il tessuto in modo che il rettangolo fatto dal bordo idrofobico intorno al tessuto sia riempito. Fare attenzione a non aggiungere troppa soluzione per traboccare il confine idrofobico. Chiudere la scatola delicatamente. Incubare durante la notte (16 h) a 50 gradi centigradi al buio. Se l’incubatrice ha una finestra, coprirla con un foglio di alluminio per creare un ambiente scuro. NOT:</ Per un segnale affidabile è necessaria una temperatura di ibridazione al di sotto della temperatura di fusione della sonda FISH. 50 gradi centigradi è la temperatura ottimale per la sonda rRNA universale 16S, ma potrebbe non essere ottimale per altre sonde. La mattina seguente, preparare almeno 500 mL di tampone Wash composto da 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) in ddH2O e filtrare-sterilizzare in una bottiglia sterile con un filtro sottovuoto bottiglia-top. Riscaldare fino a 50-56 gradi centigradi in un bagno d’acqua. Rimuovere i vetrini dalle camere umide e spazzare via con attenzione qualsiasi soluzione di ibridazione rimanente con un Kimwipe. Posizionare i vetrini in un rack di colorazione verticale. Collocare il rack di colorazione in un barattolo DiCoplin opaco contenente 100 mL di buffer di lavaggio preriscaldato per 10 min. Se i vasi Coplin non sono opachi (ad esempio, vetro), metteteli al buio durante le fasi di incubazione, magari sotto una scatola o in un cassetto. Ripetere il passaggio di lavaggio due volte con il tampone di lavaggio fresco nei nuovi vasetti Coplin. Durante le fasi di lavaggio, preparare il contro-macchia diluindo una soluzione di riserva di 100 g/mL di Hoechst 33342 1:1,000 nel tampone di lavaggio. Allo stesso tubo, aggiungere l’agglutininina di germe di grano Alexa-555 (WGA) ad una concentrazione finale di 5g/mL e Alexa-555 Phalloidin ad una concentrazione finale di 33 nM. Conservare al buio fino a quando non è pronto per l’uso. NOT:</ Hoechst, Alexa-555 WGA, e Alexa-555 Phalloidin etichetta DNA, mucin/uroplakins, e actin, rispettivamente e possono essere conservati a lungo termine al buio secondo le istruzioni del produttore. Le etichette fluorescenti utilizzate per sonde e controstaine possono essere personalizzate per i set di filtri disponibili per il microscopio da utilizzare. Rimuovere i vetrini dall’ultimo lavaggio e spazzare via delicatamente buffer di lavaggio in eccesso con un Kimwipe. Posizionare i vetrini a lato su un tovagliolo di carta e aggiungere 50-150 l di contro-macchia direttamente sopra il tessuto in modo che il bordo idrofobico sia riempito, ma non traboccante. Coprire fino a quattro scivoli con un criobox-top e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Rimettere i lati nel rack di colorazione e lavarsi altre due volte in vasetti Coplin con tampone di lavaggio fresco, per 10 min ciascuno. Asciugare accuratamente i vetrini dopo l’ultimo lavaggio e mettere il lato tessuto su un tovagliolo di carta sotto un criobox-top. Spremere una goccia di supporti di montaggio direttamente sulla parte superiore del tessuto. Posizionare delicatamente un coverslip di dimensioni appropriate (dipenderà dalle dimensioni della biopsia) sulla parte superiore. Premere delicatamente le bolle in quanto interferiranno con l’imaging e permettono ai vetrini rivolti al coperchio di curare durante la notte al buio. Il giorno dopo, sigillare i bordi del coperchio alla diapositiva con un leggero strato di smalto trasparente. Lasciare asciugare per 10 min al buio e poi conservare al buio a 4 gradi centigradi per la microscopia confocale. 3. Visualizzazione di 16S rRNA FISH di Confocal Microscopy NOT:</ Per questo protocollo, i migliori risultati si ottengono con un microscopio confocale a scansione laser con obiettivi 63x e 100x. Sono necessari set di filtri appropriati per la visualizzazione di fluorescenza di Hoechst, Alexa-488 e Alexa-555. Tuttavia, la microscopia fluorescente standard può essere utilizzata se non è disponibile un microscopio confocale. Questo protocollo è per un microscopio confocale a scansione laser. Accendere il microscopio confocale e il software del computer associato al microscopio per le istruzioni del produttore. Caricare la diapositiva e visualizzare con l’obiettivo 10x nel canale blu (DAPI/Hoechst). Mettere a fuoco con attenzione fino a quando i nuclei sono visibili. Una volta focalizzato, modificare l’obiettivo ad alto ingrandimento (63x o 100x). Aggiungere l’olio sopra lo scivolo di copertura. Rifocalizzare con il nuovo obiettivo, assicurandosi che la lente dell’obiettivo entri in contatto con l’olio durante la messa a fuoco. NOT:</ Utilizzare solo la messa a fuoco fine ad alto ingrandimento (63x o 100x). L’olio deve essere utilizzato solo per un obiettivo petrolifero. Valuta rapidamente ogni diapositiva attraverso l’occhio nel canale verde (eGFP/Alexa-488) per determinare quali diapositive sono FISH positive e quali sono FISH negative. NOT:</ È meglio se questa valutazione/punteggio iniziale viene fatto accecato da un individuo separato per ridurre la distorsione sperimentale. Per immaginare le biopsie colorate, iniziare con una diapositiva positiva FISH e passare alla modalità di visualizzazione del computer. Selezionare i canali 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Impostare il foro stenopeico utilizzando il canale di lunghezza d’onda più lungo, in questo caso 555. Trova il piano focale corretto per la visualizzazione dei batteri etichettati nel canale 488. Senza cambiare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza del laser e l’offset per ogni canale in modo che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia sovracorretto. Acquisire l’immagine in tutti e tre i canali. NOT:</ Usa le stesse impostazioni per il canale 488 per visualizzare ogni diapositiva di un esperimento. La potenza laser può richiedere la regolazione nei canali 405 e 555 se il piano focale ottimale per la visualizzazione batterica cambia tra i campi. Ripetere su campi aggiuntivi fino all’acquisizione di immagini dell’intera superficie epiteliale. NOT:</ Potrebbe essere necessario modificare leggermente il piano focale per visualizzare i batteri etichettati in campi diversi, ma non modificare mai il guadagno, la potenza del laser o l’offset per il canale 488 tra i campi. Se si lavora su un microscopio confocale, può essere informativo per catturare uno stack di z in modo che la localizzazione tridimensionale dei batteri all’interno del tessuto può essere analizzata. Elabora immagini e quantifica i batteri etichettati all’interno o associati al tessuto utilizzando ImageJ o software simili. Si raccomanda un’elaborazione minima delle immagini (ad esempio, la divisione/unione dei canali e la conversione in file di immagine), anche se, se necessario, può essere eseguita una correzione dello sfondo. Tutte le correzioni o altre modifiche devono rimanere coerenti tra le immagini.