Summary

Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5′ y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5′, y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.

Abstract

En las mitocondrias vegetales, algunas transcripciones en estado estacionario tienen 5′ trifosfato derivado de la iniciación de la transcripción (transcripciones primarias), mientras que los otros contienen 5′ monofosfato generado post-transcripción (transcripciones procesadas). Para discriminar entre los dos tipos de transcripciones, se han desarrollado varias estrategias, y la mayoría de ellas dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5′. Sin embargo, el trifosfato en la primaria 5′ termini es inestable, y dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones. Para diferenciar y mapear sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas de forma estable en el mitocondrion de maíz, hemos desarrollado una estrategia circular basada en RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, tratamiento de polifoshpatase de ARN 5′, cuantitativa RT-PCR (RT-qPCR) y Northern blot. Como mejora, esta estrategia incluye un paso de normalización de ARN para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5′.

En este protocolo, el ARN mitocondrial enriquecido es pretratado por la polifosfatasa de ARN 5′, que convierte el triphsofato de 5′ en monofosfato. Después de la circularización y la transcripción inversa, los dos CDNderivados derivados de ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5′ se normalizan mediante el ARNm maduro de maíz 26S, que tiene un extremo procesado de 5′ y es insensible a 5′ polifosfatasa. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos de los ARN tratados y no tratados. La transcripción termini se determina mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y luego verificada por Northern blot.

Mediante el uso de esta estrategia, se han determinado la mayoría de las transcripciones en estado estacionario en mitocondrion de maíz. Debido al complicado patrón de transcripción de algunos genes mitocondriales, algunas transcripciones en estado estacionario no se diferenciaron y/o mapearon, aunque se detectaron en una mancha del norte. No estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para discriminar y mapear las transcripciones de estado estacionario en otras mitocondrias vegetales o en plastoides.

Introduction

En las mitocondrias vegetales, muchos ARN maduros y precursores se acumulan como múltiples isoformas, y las transcripciones de estado estacionario se pueden dividir en dos grupos basados en la diferencia en sus extremos de 5′1,2,3, 4. Las transcripciones primarias tienen extremos de trifosfato de 5′, que se derivan de la iniciación de la transcripción. Por el contrario, las transcripciones procesadas tienen 5′ monofosfato generado por el procesamiento post-transcripción. La discriminación y el mapeo de los dos tipos de transcripciones son importantes para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcripción y la maduración final de la transcripción.

Para distinguir entre las transcripciones primarias y procesadas en el mitocondrion vegetal, se han desarrollado cuatro estrategias principales. La primera estrategia es pretratar los ARN mitocondriales con pirofosfatasa de ácido tabaco (TAP), que convierte el trifosfato de 5′ en monofosfato y permite que las transcripciones primarias sean circularizadas por ARN ligatado. Las abundancias de transcripción de muestras de ARN tratadas con TAP y no tratadas se comparan entonces por la amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) o RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. En la segunda estrategia, las transcripciones procesadas se agotan en primer lugar de los ARN mitocondriales utilizando exonucleasa dependiente del terminador 5′-fosfato (TEX), y las transcripciones primarias que quedan se mapean mediante el análisis de extensión de imprimación5,6 . La tercera estrategia es pre-tapar las transcripciones primarias usando guanylyl transferasa, y luego la posición de trifosfato 5′ termini se determina mediante la extensión de imprimación junto con el análisis de protección de la nucleasa S17,8 ,9. A diferencia de las que dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5′, la cuarta estrategia combina transcripción in vitro, mutagénesis dirigida por el sitio y análisis de extensión de imprimación para caracterizar a los promotores putativos y determinar la transcripción sitiosdeiniciación 8,10,11. Mediante el uso de estas estrategias, se han determinado muchas transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias vegetales.

Sin embargo, varios estudios han informado de que el trifosfato de 5′ de transcripciones primarias eran inestables, y se convirtieron fácilmente en monofosfato por razón desconocida2,4,12,13. Este problema dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones mediante el uso de técnicas en función de la presencia/ausencia de trifosfato de 5′, y esfuerzos anteriores para discriminar sistemáticamente entre las transcripciones primarias y procesadas en la planta mitocondrias falló2,12.

En este protocolo, combinamos cRT-PCR, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5′, RT-qPCR y Northern blot para distinguir sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en maíz (Zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR permite el mapeo simultáneo de 5′ y 3′ extremidades de una molécula deARN, y generalmente se adapta a la transcripción de mapa termini en plantas 2,12,14,15. ARN 5′ polifosfatasa podría eliminar dos fosfatos de la trifosfato 5′ termini, lo que hace que las transcripciones primarias estén disponibles para la auto-ligación por ARN ligasa. Estudios anteriores mostraron que el ARNm maduro 26S en el maíz había procesado 5′ terminus, y era insensible al ARN 5′ polifosfatasa1,16. Para minimizar la influencia del trifosfato inestable en los 5′ termini primarios, los ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5′ se normalizan mediante arNM maduros de 26S, y las transcripciones primarias y procesadas se diferencian comparando las cRT-PCR obtenidos de las dos muestras de ARN. Los resultados de la asignación cRT-PCR y la discriminación son verificados por Northern blot y RT-qPCR, respectivamente. Por último, se utilizan imprimaciones alternativas para amplificar las transcripciones detectadas en Northern blot pero no por cRT-PCR. Mediante el uso de esta estrategia basada en cRT-PCR, la mayoría de las transcripciones de estado estacionario en mitocondrion de maíz se han diferenciado y mapeado1.

Protocol

1. Primer diseño Diseñar imprimadores específicos de genes para transcripción inversa (RT) utilizando el software de diseño de imprimación PCR (Tablade Materiales)basados en las reglas generales del diseño de imprimación17.NOTA: Los imprimadores RT son muy específicos para las transcripciones de destino, y generalmente están anclados en la parte de 5′ de las secuencias de codificación (RNN maduros y ARN precursores), o 500-600 nt aguas aba…

Representative Results

Estimación de la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial En un estudio anterior, se utilizaron ARN totales y mitocondriales para la cartografía cRT-PCR de transcripción mitocondrial termini en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), y los dos tipos de ARN dieron resultados cartográficos similares12. Inicialmente, también usamos ARN totales para el mapeo c…

Discussion

En un estudio anterior, los ARN totales y mitocondriales del cultivo de suspensión celular de Arabidopsis se utilizaron para mapear la transcripción mitocondrial termini por cRT-PCR, y se obtuvieron resultados similares12. Sin embargo, sólo el ARN mitocondrial enriquecido se utilizó para mapear la transcripción mitocondrial termini en muchos otros estudios1,2,3,9…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (concesión no 31600250, Y.Z.), Proyectos de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Guangzhou (concesión no 201804020015, H.N.) y el Sistema de Investigación Agrícola de China (concesión no. CARS-04-PS09, H.N.).

Materials

Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

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Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

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