Summary

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l’influenza del tripofatore instabile 5′, ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.

Abstract

Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5′ triposfato derivato dall’initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5′ monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7′ triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5′ è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5′, RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell’RNA per ridurre al minimo l’influenza del tripfosfato unstable 5′.

In questo protocollo, l’RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5′ polifosforasi, che converte il triphsofato da 5′ in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5′ RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5′ ed è insensibile a 5′ polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.

Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.

Introduction

Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ‘ estremità1,2,3 4. Le trascrizioni primarie hanno 5′ estremità triposphate, che derivano dall’avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5′ monofafato generato dall’elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecolari alla base della trascrizione e della maturazione finale della trascrizione.

Per distinguere tra le trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio vegetale, sono state sviluppate quattro strategie principali. La prima strategia consiste nel pretrattare gli RNA mitocondriali con il pirofosofasi acido del tabacco (TAP), che converte il tripfosfato 5′ in monofagofato e consente alle trascrizioni primarie di essere circolati dalla ligase dell’RNA. L’abbondanza di trascrizioni di campioni di RNA trattati con TAP e non trattati viene quindi confrontata con una rapida amplificazione delle estremità cDNA (RACE) o RT-PCR circolari (cRT-PCR)2,3,4. Nella seconda strategia, le trascrizioni elaborate vengono prima esaurite dagli RNA mitocondriali utilizzando l’eonuclease dipendente dal terminator5-fosfatio (TEX), e le trascrizioni primarie rimaste vengono quindi mappate dall’analisi dell’estensione del primer5,6 . La terza strategia è quella di pre-cap le trascrizioni primarie utilizzando guanylyl transferase, e quindi la posizione di triposphated 5′ è determinata dall’estensione primer insieme con ribonuclease o S1 nuclease protection analysis7,8 ,9. A differenza di quelli che dipendono dalla presenza/assenza di 7′ triposfato, la quarta strategia combina la trascrizione in vitro, la mutagenesi diretta dal sito e l’analisi dell’estensione del primer per caratterizzare i promotori putativi e determinare la trascrizione siti di avvio8,10,11. Utilizzando queste strategie, molte trascrizioni primarie ed elaborate sono state determinate nei mitocondri delle piante.

Tuttavia, diversi studi hanno riferito che il trifosfato 5′ delle trascrizioni primarie erano instabili, e sono stati facilmente convertiti in monofosfato per motivo sconosciuto2,4,12,13. Questo problema ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni utilizzando tecniche a seconda della presenza/assenza di trifosfato 5′ e precedenti sforzi per distinguere sistematicamente tra le trascrizioni primarie ed elaborate nell’impianto mitocondri fallito2,12.

In questo protocollo, combiniamo cRT-PCR, trattamento polifosforo RNA 5′, RT-qPCR e macchia settentrionale per distinguere sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mais (zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR consente la mappatura simultanea delle estremità 5′ e 3′ di una molecola di RNA, ed è di solito adattata alla trascrizione dei termini nelle piante2,12,14,15. Il polifosforasi di RNA 5′ potrebbe rimuovere due fosfati dal termine di 1’trhafated 5′, il che rende disponibili le trascrizioni primarie per l’auto-legatura da parte della ligase dell’RNA. Studi precedenti hanno dimostrato che il rRNA 26S maturo nel mais aveva elaborato il capolinea 5′, ed era insensibile al polifosculo DI RNA 5 ‘1,16. Per ridurre al minimo l’influenza del triposfato instabile ai termini primari 5′, i 5′ RNA trattati con polifofofofosi e non trattati vengono normalizzati da rRNA 26S maturi, e le trascrizioni primarie ed elaborate vengono quindi differenziate confrontando cRT-PCR ottenuti dai due campioni di RNA. I risultati della mappatura cRT-PCR e della discriminazione sono verificati rispettivamente da Northern blot e RT-qPCR. Infine, i primer alternativi vengono utilizzati per amplificare le trascrizioni rilevate nella macchia settentrionale, ma non da cRT-PCR. Utilizzando questa strategia basata su cRT-PCR, la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais sono state differenziate e mappate1.

Protocol

1. Progettazione di Primer Progettare primer gene-specific per la trascrizione inversa (RT) utilizzando il software di progettazione del primer PCR (Table of Materials) in base alle regole generali di primer design17. NOT:</ I primer RT sono altamente specifici per le trascrizioni di destinazione, e sono generalmente ancorati sulla parte 5′ delle sequenze di codifica (mRNA maturi e RNA precursori), o 500-600 nt a valle della fine prevista 5′ (18S e 26S r…

Representative Results

Stima dell’efficienza di circolarizzazione dell’RNA mitocondriale In uno studio precedente, sia gli RNA totali che quelli mitocondriali sono stati utilizzati per la mappatura cRT-PCR della trascrizione mitocondriale termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e i due tipi di RNA hanno dato risultati di mappatura simili12. Inizialmente, abbiamo anche usato RNA totali pe…

Discussion

In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell’Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti12. Tuttavia, solo l’RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi1,2,3,<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31600250, Y. , Science and Technology Projects of Guangzhou City (grant n. 201804020015, H.N.) e dal China Agricultural Research System (grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

Materials

Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

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Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

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