Summary

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

Мы представляем круговую стратегию на основе РТ-ПЦР путем объединения круговой РТ-ПЦР, количественного RT-PCR, полифосфатазы РНК 5 и Северной подья. Этот протокол включает в себя шаг нормализации, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5′ трифосфат, и он подходит для распознавания и отображения первичных и обработанных стенограмм стабильно накопленных в митохондрии кукурузы.

Abstract

В митохондриях растений, некоторые устойчивые состояния стенограммы имеют 5′ трифосфат, полученный из транскрипции инициации (первичные транскрипты), в то время как другие содержат 5′ монофосфата, генерируемого посттранскриптионно (обработанные транскрипты). Для разлиения между этими двумя типами стенограмм было разработано несколько стратегий, и большинство из них зависит от наличия/отсутствия 5′ трифосфата. Тем не менее, трифосфат на первичном 5 ‘ termini нестабилен, и это препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм. Для систематического дифференцировать и картировать первичные и обработанные транскрипты, старично накопленные в митохондрии кукурузы, мы разработали круговую стратегию на основе RT-PCR (cRT-PCR) путем объединения cRT-PCR, лечения полифошпатазы RNA 5, количественной РТ-ПЦР (РТ-кПкР) и Северная поместье. В качестве улучшения, эта стратегия включает в себя шаг нормализации РНК, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5’ трифосфата.

В этом протоколе обогащенная митохондриальная РНК предварительно обрабатывается полифосфатами РНК 5, которая преобразует 5′ трифофат в монофосфат. После круговой и обратной транскрипции, два cDNAs, полученных из 5′ полифосфатазы и необработанных РНК нормализуются кукурузой 26S зрелой rRNA, которая имеет обработанный 5 ‘ конец и нечувствительна к 5’ полифосфаза. После нормализации первичные и обработанные транскрипты дискриминируются путем сравнения продуктов cRT-PCR и RT-qPCR, полученных из обработанных и необработанных РНК. Транскрипт термини определяются путем клонирования и секвенирования продуктов CRT-PCR, а затем проверяются Северной подись.

С помощью этой стратегии, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были определены. Из-за сложной схемы транскрипта некоторых митохондриальных генов, несколько транскриптов устойчивого состояния не были дифференцированы и/или отображены, хотя они были обнаружены в северной погредете. Мы не уверены, подходит ли эта стратегия для дискриминации и картирования стабильного состояния стенограммы в других митохондриях растений или в пластидов.

Introduction

В митохондриях растений, многие зрелые и предшественники РНК накапливаются как несколько изоформ, и устойчивый состояние стенограммы могут быть разделены на две группы на основе разницы в их 5 ‘концы1,2,3, 4. Первичные транскрипты имеют 5′ трифосфатных концов, которые получены от инициации транскрипции. В отличие от этого, обработанные транскрипты имеют 5′ монофосфат, генерируемый посттранскрипционной обработкой. Дискриминация и картирование двух типов транскриптов имеют важное значение для разгадки молекулярных механизмов, лежащих в основе транскрипции и транскрипта конца созревания.

Для проведения различия между первичными и обработанными транскриптами в митохондрии растений были разработаны четыре основные стратегии. Первая стратегия заключается в предварительной обработке митохондриальных РНК с табачной кислотой пирофосфаза (TAP), которая преобразует 5′ трифосфат в монофосфат и позволяет первичных транскриптов быть циркуляризированы РНК лигазы. Стенограмма обилия TAP-обработанных и необработанных образцов РНК затем сравниваются путем быстрого усиления концов кДНК (RACE) или круговой RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Во второй стратегии, обработанные стенограммы сначала истощаются из митохондриальных РНК с использованием терминатора 5′-фосфат-зависимых экзонуклеизы (TEX), и первичные стенограммы слева затем отображаются грунтового анализа расширения5,6 . Третья стратегия заключается в предварительной крышкой первичных стенограмм с использованием guanylyl transferase, а затем положение triphosphated 5 ‘ termini определяется грунтовка расширение вместе с ribonuclease или S1 нуклеаза анализ защиты7,8 ,9. В отличие от тех, в зависимости от наличия / отсутствия 5′ трифосфата, четвертая стратегия сочетает в себе в пробирке транскрипции, сайт-направленный мутагенез, и анализ расширения грунтовки, чтобы охарактеризовать предполагаемых промоутеров и определить транскрипцию сайтыпосвящения 8,10,11. С помощью этих стратегий, многие первичные и обработанные стенограммы были определены в митохондриях растений.

Тем не менее, несколько исследований сообщили, что 5′ трифосфат первичных стенограмм были нестабильны, и они были легко преобразованы в монофосфат по неизвестной причине2,4,12,13. Эта проблема препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм с помощью методов в зависимости от наличия/отсутствия 5′ трифосфата, а также предыдущих попыток систематически различать первичные и обработанные транскрипты на заводе митохондрий не удалось2,12.

В этом протоколе мы объединяем cRT-PCR, лечение полифосфатазы РНК 5, RT-qPCR и Северный пятно, чтобы систематически различать первичные и обработанные транскрипты, стабилизированные в кукурузе(Цеа май)митохондрион (рисунок1). cRT-PCR позволяет одновременное отображение 5′ и 3′ конечностей молекулы РНК, и это обычно адаптированы для карты транскрипт термини в растениях2,12,14,15. ПОЛифосфатаза РНК 5’может удалить два фосфата из трифосфатных 5′ termini, что делает первичные транскрипты доступны для самостоятельной лигиции РНК лигаза. Предыдущие исследования показали, что зрелые 26S rRNA в кукурузе были обработаны 5 ‘ терминов, и он был нечувствительным к РНК 5’ полифосфатаза1,16. Чтобы свести к минимуму влияние нестабильного трифосфата на первичные 5′ термини, 5′ полифосфатазно-обработанные и необработанные РНК нормализуются зрелыми 26S rRNA, а первичные и обработанные транскрипты затем дифференцированы путем сравнения продукты cRT-PCR, полученные из двух образцов РНК. Результаты картирования и дискриминации cRT-PCR проверяются соответственно “Северным пятном” и РТ-кПкР. Наконец, альтернативные праймеры используются для усиления этих транскриптов, обнаруженных в Северном пятно, но не cRT-PCR. С помощью этой стратегии на основе cRT-PCR, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были дифференцированы и отображены1.

Protocol

1. Праймер Дизайн Дизайн генных праймеров для обратной транскрипции (RT) с использованием ПЦР праймер дизайн программного обеспечения (Таблица материалов) на основе общих правил грунтовки дизайн17.ПРИМЕЧАНИЕ: RT праймеры очень специфичны для целевых…

Representative Results

Оценка эффективности циркуляризации митохондриальной РНК В предыдущем исследовании, как общий и митохондриальной РНК были использованы для cRT-PCR картирования митохондриальной транскрипт термини в Arabidopsis (Arabidopsis thaliana</e…

Discussion

В предыдущем исследовании, всего и митохондриальных РНК из клеточной культуры подвески Arabidopsis были использованы для картирования митохондриальной транскрипт термини cRT-PCR, и аналогичные результаты были получены12. Однако, только обогащенная митохондриальная РНК была …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31600250, Y.З.), Научно-технические проекты города Гуанчжоу (грант No 201804020015, H.N.), и Китайской системой сельскохозяйственных исследований (грант No). КАРС-04-PS09, H.N.).

Materials

Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

View Video