Summary

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Published: August 16, 2019
doi:

Summary

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Abstract

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) çeşitli biyolojik ve biyolojik olmayan numunelerin ultra-yapısal analizinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, farklı biyolojik numunelerin işlenmesinde kullanılan yöntemler benzersiz uygulamalar içerir. Örneklerin işlenmesi için literatürde açıklanan tüm geleneksel uygulamalar hala yararlı uygulamalar bulmak, ancak örnek hazırlama ince değişiklikler görüntü kalitesini değiştirebilir, hem de, eserler tanıtmak. Bu nedenle, analiz edilen doku tipine özgü benzersiz bir numune hazırlama tekniği nin kullanılması, ultrayapısal çözünürlüğe sahip kaliteli bir görüntü elde etmek için gereklidir. Bu çalışmanın odak noktası SEM kullanarak embriyolar, sert yumurta kabukları ve mantar kültürleri görüntüleme için en uygun örnek hazırlama protokolleri sağlamaktır. İncelenen üç farklı hassas biyolojik örnek için iyi sonuçlar vermek için aşağıdaki optimizasyonlar önerildi. %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit ve ardından etanol serisi ile dehidratasyon gibi daha hafif fiksatiflerin kullanılması zorunludur. Slayt kültürleri tarafından elde edilen agar bloklar üzerindeki mantar miseli, doğrudan agar plakalarından alınan kültürlere göre daha iyi bir ultrayapısal bütünlük sağlar. HMDS ile embriyoların kimyasal olarak kurutulması, kritik nokta kurutmasına kıyasla yüzey gerilimi objeleri kullanılmadan kurutulmasını sağlar. HMDS, numuneler kurutma sırasında daha az kırılgan olduğundan büzülmenin neden olduğu çatlamaları önler. Ancak, mantar kültürü için, kritik nokta kurutma kimyasal kurutma ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir görüntü kalitesi sağlar. Yumurta kabukları montajdan önce iyice yıkama ve hava kurutma dışında özel bir hazırlık adımı olmadan görüntülenebilir. Hazırlama metodolojileri, her denemede elde edilen kabul edilebilir görüntü kalitesine göre standartlaştırılmıştır.

Introduction

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ultrastrüktürel analizi ve hücre içi görüntüleme prokaryotların, bitkilerin ve hayvanların üç boyutlu profilini çıkarmak için ışık mikroskobunu tamamlar. Bir SEM’nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, onu nanometreden mikrometre ölçeğine kadar numunelerin mikroyapısal özelliklerinin incelenmesi için mevcut olan en çok yönlü ve güçlü tekniklerden biri haline getirir. Kurutulmuş numuneler, fonksiyonel ilişkiler hakkında geçerli sonuçlar geliştirmenin temelini oluşturan, yoğun ayrıntılarla kompozisyon ve topografik yapılara çözülür1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9– Biyolojik örneklerin SEM görüntüleri yorumlarken, doğal yapılar ve işleme sırasında oluşturulan eserler arasında ayrım yapmak büyük bir meydan okumadır. SEM genellikle örnek10,11yayılan birincil, ikincil veya geri dağınık elektron ışınları etkileyen gaz molekülleri herhangi bir girişim önlemek için çok yüksek vakumlar çalıştırılır. Ayrıca, biyolojik maddeler kötü veya iletken olmayan özellikleri nedeniyle radyasyon hasarına duyarlıdır. Sem’e yüklenen numunelerin tamamen kuru ve organik kirletici maddelerden arındırılmış olması ve yüksek vakum ortamında gazgiderme olasılığına karşı 10,11. Biyolojik numuneler çoğunlukla sudan oluştuğu için, yerli yapıların korunmasını sağlamak için ek preparatif teknikler gereklidir.

Elde edilen çözünürlük, numune tiplerine ve kullanılan enstrümental parametrelere özgü hazırlama yöntemlerinin optimize edilmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, tüm doku tipleri için genelleştirilmiş işleme adımları kullanmaktan kaçınmak gerekir. Bazı biyolojik numuneler yapılarını korumak için daha az sıkı işleme gerektirirken, büzülme ve çökme gibi kurutma eserlerinin piyasaya sürülmesini önlemek için hassas numune türleri için daha fazla zaman ve bakım gerekebilir. Örnek hazırlama SEM görüntülemede kritik bir adımdır; morfometrik çalışmaların bulguları örnek hazırlama prosedürleri12,13tarafından belirgin bir şekilde etkilenmiştir. Birçok biyolojik numune için ortak hazırlık adımları, yüzeylerini SEM analizi için iletken olarak dönüştürmek için altın, platin veya paladyum gibi bir metalle fiksasyon, dehidratasyon ve kaplamadır. Kullanılan adımların niteliği ve kombinasyonu dokunun türüne ve çalışmanın özel hedeflerine bağlı olarak değişir. Şarj birikmesi, vakum ve elektron ışını hasarına duyarlılık yumuşak hassas biyolojik numuneleri işlerken sorun teşkil ederek nesnenin doğal yapısını korumak için ek işleme adımları gerektirir. Osmiyum tetroksit sabitleme gibi konvansiyonel yöntemler kullanarak, ve dehidratasyon büzülme ve hassas dokuların çöküşüneden14,15,16,17. Çalışmanın amacı, yumuşak hassas dokuları (örneğin, sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabuğu ve mantar kültürleri) hazırlamak ve imajlandırmak için yapılan değişikliklerle önceki çalışmalardan elde edilen fikirleri birleştirerek elde edilen zarif metodolojiler oluşturmaktır.

Uygun bir sabitleme yönteminin seçilmesi biyolojik örneklerin mikroskobik analizi için ilk önemli adımdır. Bir organizmadan izole sonra hemen dokuların düzeltilmesi çürümeye bağlı morfolojilerinde değişimi önlemek için gereklidir. Etkili bir fiksatif, hücreleri hızlı bir şekilde etkileyerek ve numunenin yapısını stabilize etmek için etkisini geri dönülmez bir şekilde koruyarak hücresel süreçleri sona erdirmeli ve hem sonraki işlem adımlarına hem de SEM17 altında incelemeye dayanmalıdır. , 18. Çeşitli kimyasal ve fiziksel fiksasyon yöntemleri bilinmesine rağmen, kimyasal fiksasyon daha yaygın biyolojik örnekler için otoliz, putrefaction ve kurutma etkileri nedeniyle herhangi bir hücresel değişiklikleri önlemek için kullanılır. Literatürde tartışılan çok sayıda fiksatif kimyasal formülasyonlar vardır17,19,20,21,22,23, denaturing tarafından çalışmak fiksatifler ve biyolojik makromoleküllerin pıhtılaşma, ve kovalent çapraz-bağlantı makromoleküller tarafından düzeltmek olanlar. Alkoller ultrayapıyı çok kötü koruyan ve çoğunlukla ışık mikroskobu için kullanılan ve elektron mikroskobik analizi için tavsiye edilmeyen denaturing fiksatifler olarak kullanılır. Formaldehit, glutaraldehit ve osmium tetroksit gibi çapraz bağlantı fiksatifler dokular içindeki makromoleküller arasında moleküler ve intramoleküler çapraz bağlantı oluşturarak ultra yapıların mükemmel korunmasını sağlar11 ,24,25,26. Biyolojik numuneler sıcaklığa duyarlıdır. Fiksasyon başında sıcaklık membran proteinlerinin yanal hareketliliğini azaltmak için 4 °C olması tavsiye edilir, hücreler arası moleküllerin difüzyonunu yavaşlatmak için, ve fiksasyon hızını yavaşlatmak için11. Dokuların düzeltilmesi için gereken süre büyük ölçüde numunenin boyutuna ve fiksatif in numunenin bileşenleriyle birlikte yayıldığı ve tepki verdiği hıza bağlıdır. 4 °C’de PBS’de %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit de bir gecede fiksasyon, bu çalışmada kullanılan örneklerin sıralı penetratif özellikleri açısından SEM analizi nde tercih edilen yöntemdir ve daha küçük hassas numunelerin işlenmesine olanak sağlar17 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 27– Osmiyum tetroksit ile bir fiksasyon sonrası adım sadece toksik doğası nedeniyle ortadan kaldırılır ama aynı zamanda bu çalışmada analiz örnekleri için görüntü kalitesini artırmak için hiçbir ek avantaj uygulamak bulundu.

Biyolojik numuneler SEM işlemini engelleyen sıvılar içerir; bu nedenle, örneklerin SEM numune odasına yerleştirilmeden önce kurutulması gerekir. Dehidratasyon sağlandıktan sonra, yüzey gerilimi/kuruma nedeniyle numunelere objeler oluşturulmadan çözücü dokudan uzaklaştırılmalıdır. Üç farklı kurutma yöntemleri yaygın SEM görüntüleme için dokuların işlenmesi sırasında kullanılmıştır: hava kurutma, kritik nokta kurutma, ve dondurma kurutma örnekleri28,29,30,31. Birkaç çalışma hayvan dokusu örnekleri28,29,30,31ile aynı sonuçları üreten üç kurutma yöntemleri rapor. Daha küçük numuneler için kullanılan genel bir uygulama alkol ve hexamethyldisilazane konsantrasyon serisi artan kimyasal dehidratasyon vardır (HMDS), ancak daha büyük örnekler kritik bir nokta kurutma kullanılarak kurutulur (CPD) alet32. Kurutma işlemi sırasında, numuneden sıvı/gaz arabirimi ile geçen küçük boşluklarda oluşan önemli kuvvetler; bu bile içi boş yapıların tam bir çöküşüne yol açabilir33. Tedavi nedeniyle meydana gelen herhangi bir deformasyon daha sonra numunenin doğal yapısal bir özelliği olarak yanlış olabilir. Bu nedenle, işleme için genelleştirilmiş fenomen ortadan kaldırılmalı ve özellikle hassas doku örnekleri analiz edildiğinde her doku tipi için benzersiz bir kurutma işlemi standartlaştırılmalıdır.

Yukarıda bahsedilen tüm süreçlerin çeşitli kombinasyonu kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalarda, üç hassas dokuların SEM analizi için kullanılabilecek yöntemleri standartlaştırdık: sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabukları ve mantar kültürleri. Gelişimbiyologları ve morfolojistler temsili omurgalı hayvanlarda embriyo gelişimi sırasında normal ve anormal morfogenezi tanımlarlar. Gen sinyal yolları üzerinde yapılan araştırmalar yeni yapıların morfolojik tanımına bağlıdır. SEM analizi sırasında omurgalı embriyo yapısında ani bir değişiklik olmasını önlemek için, dehidratasyon sonrası kimyasal kuruma öneririz. HMDS kullanarak kimyasal kurutma nispeten yeni kurutma yöntemi dir ve avantajları göreceli çabukluk, kullanım kolaylığı, kayıp maliyet ve sınırlı uzmanlık ve ekipman9gerekli içerir. CPD, numuneler arasında belirli bir sıcaklık ve basınçta paslama CO2 kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir kurutma tekniğidir. HMDS’nin yumuşak hassas dokuların kurutulması için uygun olduğunu ve embriyonik dokularda kapsamlı deformasyona neden olan kritik nokta kurumasına göre daha büyük numunelerin işlenmesine olanak sağladığını belirledik. Mantarların morfolojik özelliklerini incelemek için SEM görüntüleme için örnekler hazırlamak için çeşitli yöntemler kullanılmıştır34. Mantar örnekleri genellikle osmiyum tetroksit etanol dehidratasyon ve kritik nokta kurutma takip sabittir, hangi tatmin edici sonuçlar sağlayabilir,osmiyum tetroksit toksik etkileri 6 rağmen,7,35 ve işleme sırasında çözelti değiştirirken mantar malzemelerini kaybetme dezavantajları belirgindir. Fiksasyon olmadan hava kurutma tekniği de uygulanmıştır36, ancak küçülmüş ve çökmüş yapılarla sonuçlanmıştır ve bu tür örneklerin gözlemi, türleri karakterize ederken kolayca yanlış yorumlanabilir. Mantar hypha sıvılar ile temas bütünlüğünü kaybeder ve hatta kurutma yapısı geri elde olmayabilir. Bu etki nedeniyle, donma-kurutma genellikle mantar misel gibi yumuşak dokuların kurutma için kullanılır. Dondurma kurutma temiz malzemeler için iyi çalışır ancak herhangi bir tuz veya salgı varlığı sadece SEM görüntüleme aşamasında tespit edilecek yüzey detay belirsiz olacaktır. Biz bozulmamış mantar hyphae ve sporların yapısal detayları verim için glutaraldehit sabitleme ve kritik nokta kurutma ile slayt kültür yöntemi birleştiğinde. CPD kurutma embriyolarda büzülme neden olmasına rağmen, glutaraldehit fiksasyonu ile birleştiğinde iyi korunmuş misel yapıları sonuçlandı. Yumurta kabuğu sadece koruyucu bir kaplama olarak hareket değil, aynı zamanda mekanik istikrar, gaz ve su geçirgenliği ve gelişmekte olan embriyo için bir kalsiyum rezervi sağlayarak oviparous hayvanların embriyo için birincil önemtaşımaktadır. Tatlı su kaplumbağası yumurta kabukları kendi yapısına göre “sert” olarak sınıflandırılır veonların durumu nedeniyle biyologlar 1,2,3,4 önemli ilgi almış , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 37.000 , 38′e kadar.

Biz herhangi bir sert yumurta kabuğu türlerine uygulanabilir boyalı kaplumbağa yumurta kabuğu ve kabuk membranlar kolay incelenmesi için basit yöntemler detay. Hazırlık metodolojileri, ortaya çıkan görüntü kalitesi ve azaltılmış potansiyel eserlere göre değerlendirildi.

Protocol

NOT: Bu çalışmada kullanılan boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta)yumurtaları Mayıs-Haziran 2015-16 yılları arasında New York Çevre Bakanlığı’ndan alınan izinle Oswego New York’taki Rice Creek Saha İstasyonu’ndan toplanmıştır. Koruma (DEC). 1. SEM için embriyoları işlemek için kimyasal kurutma yöntemi Yuvalama mevsiminde tarla sitelerinden kaplumbağa yumurtaları toplayın. Kapaklı plastik kutulardan (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm dolgulu yem …

Representative Results

Şekil 1, boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta) embriyolarının taramalı elektron mikrografik analizini göstermektedir. Kimyasal kuruduktan sonra alüminyum saplara monte edilen bir yatak makinesinde toplanan ve kuluçkaya yatan boyalı kaplumbağa yumurtaları SEM görüntüleme için kullanılmıştır (Şekil 1A-E). Evre 12 embriyonun yanal görünümü kraniyofasiyal yapıları gösterir; maksiller önem mandibular ötesine uzanı…

Discussion

Çalışmamızda sem görüntüleme için üç farklı hassas biyolojik örnek hazırlamak için farklı fiksasyon ajanları, dehidratasyon ve kurutma yöntemleri test edilmiştir: embriyolar, yumurta kabukları ve mantar kültürleri. SEM genellikle yüzey analizi için kullanılır, bu nedenle fiksatif penetrasyon daha az endişe vericidir, ancak kötü sabit iç yapıların içe doğru küçülmeye veya/ve çökmüş yüzey yapılarına neden olacağı anlaşılmalıdır. Daha büyük doku örnekleri için de uzun fik…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego yararlı tartışmalar ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Rice Creek Associate Grants, Oswego tarafından desteklenmiştir; Challenge Grants SUNY Oswego ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) PGL ve JG için Küçük Hibeler.

Materials

Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

References

  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. . Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. . Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. . Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , (2000).
  18. Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O’Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate “Gymnodinioid” Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

Play Video

Cite This Article
Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

View Video