معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،^{2،3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.}عند تفسير الصور SEM من العينات البيولوجية، فإنه من التحدي الكبير للتمييز بين الهياكل الأصلية والقطع الأثرية التي يتم إنشاؤها أثناء المعالجة. يتم تشغيل SEM عموما في فراغات عالية جدا لتجنب أي تدخل من جزيئات الغاز التي تؤثر على الحزم الإلكترونية الأولية أو الثانوية أو المتناثرة من العينة^10،11. كما أن المواد البيولوجية معرضة للتلف الإشعاعي بسبب خصائصها السيئة أو غير المنضوية. فمن الضروري للعينات المحملة في SEM أن تكون جافة تماما وخالية من أي ملوثات عضوية للقضاء على أي outgassing ممكن في بيئة فراغ عالية^10،11. وبما أن العينات البيولوجية تتألف في معظمها من الماء، فإن هناك حاجة إلى تقنيات وقائية إضافية لضمان الاحتفاظ بالهياكل الأصلية.

ويستند القرار الذي تم الحصول عليه إلى تحسين أساليب الإعداد الخاصة بأنواع العينات والمعلمات الآلية المستخدمة. وبالتالي، فمن الضروري تجنب استخدام خطوات المعالجة المعممة لجميع أنواع الأنسجة. وستحتاج بعض العينات البيولوجية إلى معالجة أقل صرامة للحفاظ على هيكلها، في حين قد يلزم مزيد من الوقت والرعاية لأنواع دقيقة من العينات لتجنب إدخال قطع التجفيف، مثل الانكماش والانهيار. إعداد العينة هو خطوة حاسمة في التصوير SEM; نتائج الدراسات المورفومترية تتأثر بشكل ملحوظ بإجراءات إعداد العينات^12،13. خطوات التحضير الشائعة للعديد من العينات البيولوجية هي التثبيت والجفاف والطلاء مع معدن مثل الذهب أو البلاتين أو البلاديوم لتحويل أسطحها لتكون موصلة لتحليل SEM. وتختلف طبيعة الخطوات المستخدمة ومزيجها حسب نوع الأنسجة والأهداف المحددة للدراسة. زيادة تهمة، والحساسية للفراغ والضرر شعاع الإلكترون تشكل مشاكل عند معالجة عينات البيولوجية الحساسة لينة، مما يتطلب خطوات معالجة إضافية للحفاظ على الهيكل الأصلي للكائن. استخدام الأساليب التقليدية مثل تحديد تتروكسيد أوزميوم، والجفاف يسبب انكماش وانهيار الأنسجة الحساسة^{14،15،16،17.} والهدف من الدراسة هو وضع منهجيات أنيقة مستمدة من الجمع بين الأفكار من الدراسات السابقة مع التعديلات لإعداد وصورة الأنسجة الحساسة الناعمة (على سبيل المثال، أجنة الزواحف، قشر البيض من السلاحف المطلية، والثقافات الفطرية).

اختيار طريقة تحديد مناسبة هي الخطوة الأولى الأكثر أهمية للتحليل المجهري للعينات البيولوجية. إصلاح الأنسجة مباشرة بعد عزل من كائن حي أمر ضروري لمنع التغيير في مورفولوجيا بسبب التحلل. يجب على المثبت الفعال إنهاء العمليات الخلوية عن طريق permeating الخلايا بسرعة والحفاظ على تأثير لا رجعة فيه لتحقيق الاستقرار في هيكل العينة لتحمل كل من خطوات المعالجة اللاحقة والفحص تحت SEM^{17 , 18.}على الرغم من أن العديد من أساليب التثبيت الكيميائي والفيزيائي معروفة، والتثبيت الكيميائي هو أكثر شيوعا للعينات البيولوجية لتجنب أي تغييرات الخلوية بسبب الانهاليس التلقائي، وتعفن، وآثار التجفيف. هناك العديد من التركيبات الكيميائية المثبتة التي نوقشت في الأدب^{17،19،20،21،22،23،}المثبتات التي تعمل عن طريق denaturing و تخثر الجزيئات البيولوجية، وتلك التي تصلح من خلال الجزيئات الكبيرة عبر التشابك بشكل مشترك. وتستخدم المشروبات الكحولية كالمثبتات denaturing التي تحافظ على البنية الفائقة سيئة جدا وتستخدم في الغالب للميكروسكوب الخفيفة ولا ينصح لتحليل مجهري الإلكترون. المثبتات عبر ربط مثل الفورمالديهايد، الجلوتارهايد، وأوستروكسيد الأوميوم خلق الترابط بين الجزيئية وداخل الجزيئية بين الجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة، وتوفير الحفاظ ممتازة من الهياكل الفائقة^{11 ،24،25،26}. العينات البيولوجية حساسة لدرجة الحرارة. ينصح درجة الحرارة في بداية التثبيت أن تكون 4 درجة مئوية للحد من الحركة الجانبية للبروتينات الغشاء، لإبطاء انتشار الجزيئات بين الخلايا، وإبطاء معدل التثبيت¹¹. الوقت اللازم لإصلاح الأنسجة يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والسرعة التي ينتشر المثبت ويتفاعل مع مكونات العينة. تثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde أو 3٪ الجلوتالالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية هو الأسلوب المفضل لتحليل SEM من العينات المستخدمة في هذه الدراسة لخصائصها اختراقية متسلسلة، والتي تسمح عينات حساسة أصغر ليتم معالجتها^{17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 27-}وزيدت خطوة ما بعد التثبيت مع تتزاز الأوميوم ليس فقط بسبب طبيعته السامة ولكن أيضاً تبين أنه لا يطبق أي ميزة إضافية لتحسين جودة الصورة للعينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة.

تحتوي العينات البيولوجية على سوائل تتداخل مع عملية SEM؛ وبالتالي، فإن العينات تحتاج إلى أن تجفف قبل إدراجه في غرفة عينة SEM. بمجرد ضمان الجفاف، يجب إزالة المذيب من الأنسجة دون إنشاء القطع الأثرية في العينات بسبب التوتر السطحي / التجفيف. وكانت هناك ثلاث طرق تجفيف مختلفة تستخدم عادة أثناء معالجة الأنسجة لتصوير SEM: تجفيف الهواء، وتجفيف نقطة حرجة، وتجميد عينات التجفيف^{28،29،30،31.} عدد قليل من الدراسات تقرير جميع أساليب التجفيف الثلاثة التي تنتج نتائج متطابقة مع عينات الأنسجة الحيوانية^{28،29،30،31.} ومن الممارسات العامة المستخدمة في العينات الصغيرة الجفاف الكيميائي عن طريق سلسلة تركيز تصاعدية من الكحول وسداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS)، ولكن يتم تجفيف عينات أكبر باستخدام أداة تجفيف نقطة حرجة (CPD)³². خلال عملية التجفيف، شكلت قوى كبيرة في تجاويف صغيرة التي يتم تمريرها من خلال العينة عن طريق واجهة السائل / الغاز؛ هذا يمكن أن يؤدي حتى إلى انهيار كامل للهياكل جوفاء³³. ويمكن عندئذ أن يخطئ أي تشوه يحدث بسبب العلاج كسمة هيكلية أصلية للعينة. وبالتالي، ينبغي القضاء على الظاهرة المعممة للمعالجة، وينبغي توحيد عملية تجفيف فريدة من نوعها لكل نوع من الأنسجة خاصة عندما يتم تحليل عينات الأنسجة الحساسة.

في العديد من التجارب التي أجريت باستخدام مزيج مختلف من جميع العمليات المذكورة أعلاه، قمنا بتوحيد الأساليب التي يمكن استخدامها لتحليل SEM لثلاثة أنسجة حساسة: أجنة الزواحف، وقذائف البيض من السلاحف المرسومة، والثقافات الفطرية. يصف علماء الأحياء التنموية وعلماء المورفولوجيا التكوين الطبيعي وغير الطبيعي أثناء نمو الأجنة في الحيوانات الفقارية التمثيلية. تعتمد التحقيقات في مسارات الإشارات الجينية على الوصف المورفولوجي للهياكل الجديدة. لتجنب أي تغيير مفاجئ في بنية الأجنة الفقارية أثناء تحليل SEM، نوصي بالتجفيف الكيميائي بعد الجفاف. التجفيف الكيميائي باستخدام HMDS هو أحدث طريقة تجفيف نسبيا وتشمل المزايا السرعة النسبية، وسهولةالاستخدام، وفقدان التكلفة، والخبرة المحدودة والمعدات اللازمة 9. CPD هو تقنية التجفيف شائعة الاستخدام باستخدام تمرير ثاني أكسيد الكربون₂ عبر العينات في درجة حرارة والضغط محددة. لقد حددنا أن HMDS مناسب لتجفيف الأنسجة الحساسة الناعمة ويسمح بمعالجة عينات أكبر مقارنة بتجفيف النقاط الحرجة، مما تسبب في تشوه واسع النطاق للأنسجة الجنينية. وقد استخدمت عدة طرق لإعداد عينات لتصوير SEM لدراسة الخصائص المورفولوجية للفطريات³⁴. يتم إصلاح العينات الفطرية عادة في تتزاز أوزميوم تليها جفاف الإيثانول وتجفيف نقطة حرجة، والتي قد توفر نتائج مرضية، على الرغم من أن الآثار السامة لأكسيد الأوساميوم^6و7و35 وفقدان المواد الفطرية أثناء تغيير الحلول أثناء المعالجة هي عيوب واضحة. كما تم ممارسة تقنية إعداد العينات باستخدام تجفيف الهواء دون تثبيت³⁶ ولكن النتائج في هياكل تقلصت ومطوية، ومراقبة مثل هذه العينات يمكن بسهولة أن يساء تفسيرها مع تميز الأنواع. الهيفا الفطرية يفقد سلامتها في الاتصال مع السوائل وحتى التجفيف قد لا يتحقق لاستعادة الهيكل. ونتيجة لهذا الغرض، يستخدم تجميد التجفيف عادة لتجفيف الأنسجة الرخوة مثل الميسليوم الفطري. تجميد التجفيف يعمل بشكل جيد للمواد النظيفة ولكن وجود أي أملاح أو إفراز سوف تحجب التفاصيل السطحية التي سيتم تحديدها فقط في مرحلة مشاهدة SEM. نحن جنبا إلى جنب مع طريقة ثقافة الشريحة مع إصلاح الجلوتارهايد والتجفيف نقطة حرجة لإنتاج التفاصيل الهيكلية من الهيبهاي الفطرية سليمة والجراثيم. على الرغم من أن تجفيف CPD تسبب انكماش في الأجنة، أدى إلى هياكل مسيليال الحفاظ عليها بشكل جيد عندما يقترن تثبيت الجلوتالالديهايد. قشر البيض هو من الأهمية بمكان لجنين الحيوانات oviparous ليس فقط من خلال العمل كغطاء وقائي ولكن أيضا توفير الاستقرار الميكانيكي، نفاذية للغاز والماء، واحتياطي الكالسيوم للجنين النامية. وتصنف قشرة بيض السلاحف في المياه العذبة على أنها “جامدة” علىأساس هيكلها، ونظرا لتوافرها قد تلقت اهتماما كبيرا من علماء الأحياء 1،^{2،3،4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

نحن بالتفصيل طرق بسيطة لسهولة فحص قشر البيض وأغشية قذيفة من السلاحف المطلية التي يمكن تطبيقها على أي أنواع قشر البيض جامدة. وتم تقييم منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة الناتجة عن ذلك وانخفاض القطع الأثرية المحتملة.