Summary

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l’imagerie intravitale de l’intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu’à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d’interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Abstract

Les lymphocytes intraépithéliales exprimant le récepteur des lymphocytes T (IEL) jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire de l’épithélium intestinal. En partie à cause de l’absence d’un ligand définitif pour le récepteur des lymphocytes T, notre compréhension de la régulation de l’activation de l’IEL et de leur fonction in vivo reste limitée. Cela nécessite l’élaboration de stratégies alternatives pour interroger les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la fonction IEL et la réactivité de ces cellules au microenvironnement local. Bien que les EI soient largement compris pour limiter la translocation des agents pathogènes, l’utilisation de l’imagerie intravitale a été essentielle pour comprendre la dynamique spatiotemporelle des interactions IEL/épithélial à l’état stable et en réponse aux agents pathogènes invasifs. Ici, nous présentons un protocole pour visualiser le comportement migratoire d’IEL dans la petite muqueuse intestinale d’une souris de journaliste de cellule T de GFP utilisant la microscopie focale focale de laser confocal de disque inversé. Bien que la profondeur maximale d’imagerie de cette approche soit limitée par rapport à l’utilisation de la microscopie à balayage laser à deux photons, la microscopie laser confocale du disque tournant offre l’avantage de l’acquisition d’images à haute vitesse avec un blanchiment de photoet et photodamage. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images 4D, le comportement de surveillance des lymphocytes T et leurs interactions avec les cellules voisines peuvent être analysés à la suite d’une manipulation expérimentale afin de fournir un aperçu supplémentaire de l’activation et de la fonction de l’IEL au sein de la muqueuse intestinale.

Introduction

Les lymphocytes intraépithéliales (IEL) sont situés dans l’épithélium intestinal, et se trouvent à la fois le long de la membrane du sous-sol et entre les cellules épithéliales adjacentes dans l’espace intercellulaire latéral1. Il y a approximativement un IEL pour chaque 5-10 cellules épithéliales ; ces IEL servent de sentinelles pour assurer la surveillance immunitaire de la grande étendue de la barrière épithéliale intestinale2. Les IEL exprimant le récepteur des lymphocytes T (TCR) représentent jusqu’à 60 % de la population totale d’IEL dans l’intestin grêle murine. Des études menées sur des souris déficientes en lymphocytes T démontrent un rôle largement protecteur de ces cellules en réponse à des lésions intestinales, à l’inflammation et à l’infection3,4,5. Malgré la génération de lasouris Kok6 Tcrd , notre compréhension de la biologie IEL reste limitée en partie en raison du fait que les ligands reconnus par le TCR n’ont pas encore été identifiés7. En conséquence, le manque d’outils pour étudier cette population cellulaire a rendu difficile d’étudier le rôle de l’activation et de la fonction de TCR dans des conditions physiologiques et pathologiques. Pour combler cette lacune, nous avons mis au point des techniques d’imagerie en direct pour visualiser le comportement migratoire et les interactions avec les entéroocytes voisins comme un moyen de fournir un aperçu supplémentaire de la fonction ETL et de la réactivité aux stimuli externes in vivo.

Au cours de la dernière décennie, l’imagerie intravitale a considérablement élargi notre compréhension des événements moléculaires impliqués dans de multiples facettes de la biologie intestinale, y compris l’excrétion épithéliale des cellules8, régulation de la fonction de barrière épithéliale9 ,10, échantillonnage de cellules myéloïdes du contenu luminal11,12, et les interactions hôte-microbe11,13,14,15,16 . Dans le contexte de la biologie IEL, l’utilisation de la microscopie intravitale a mis en lumière la dynamique spatiotemporale de la motilité IEL et les facteurs de médiation de leur comportement de surveillance13,14,15, 16. Le développement de souris reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), qui étiquettes IELs par l’expression gFP nucléaire17, a révélé que les IEL sont très motiles dans l’épithélium et présentent un comportement de surveillance unique qui est sensible aux microbiens infection17,13,14. Récemment, une autre souris de journaliste de cellule T a été développée (Tcrd-GDL) qui exprime GFP dans le cytoplasme pour permettre la visualisation de la cellule entière18. Une méthodologie similaire a été utilisée pour étudier l’exigence de récepteurs spécifiques de chimiokine, tels que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR)-18 et -55, sur la dynamique de la motilité IEL19,20. En l’absence d’un journaliste spécifique à une cellule, des anticorps conjugués fluorescents contre cD8 ont été utilisés pour visualiser et suivre la motilité IEL in vivo19,20. Bien que la microscopie à balayage laser à deux photons soit couramment utilisée pour l’imagerie intravitale, l’utilisation de la microscopie laser confocale de disque tournant offre des avantages uniques pour capturer des images multicanaux à haute vitesse et à haute résolution avec un bruit de fond minimal. Cette technologie est idéale pour élucider la dynamique spatiotemporelle des interactions immunitaires/épithéliales dans le microenvironnement complexe de la muqueuse intestinale. En outre, grâce à l’utilisation de divers modèles transgéniques et/ou de souris knock-out, ces études peuvent fournir un aperçu de la régulation moléculaire de la fonction immunitaire intestinale et/ou épithéliale.

Protocol

Toutes les études ont été menées dans une association de l’évaluation et de l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AALAC) accrédité s’installation selon les protocoles approuvés par Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources. 1. Préparation de la souris REMARQUE: La procédure suivante, y compris la préparation des animaux et la chirurgie, prendra 30 à 40 min. Avant la chirurgie, allumer le microscope e…

Representative Results

À l’aide de l’imagerie intravitale des souris reporter TcrdEGFP, nous avons déjà montré que les IEL présentent un comportement de surveillance dynamique, dans lequel ils patrouillent l’épithélium en migrant le long de la membrane du sous-sol et dans l’espace intercellulaire latéral (LIS) à stable état (Figure 2, Film 1). Cette approche peut également être utilisée pour évaluer comment l’inhibition de voies de signalisation cellulaire…

Discussion

Le développement de techniques de microscopie intravitale a fourni une occasion sans précédent d’observer la réorganisation des structures subcellulaires8,9,22, interactions cellule-cellule12, 25 et le comportement migratoire cellulaire13,14,15,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Nous remercions Madeleine Hu pour son aide dans l’édition du manuscrit et la fourniture des données présentées dans les résultats représentatifs.

Materials

35mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

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Cite This Article
Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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