Summary

Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

Published: September 26, 2019
doi:

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l’isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l’immunofenofizzazione robusta.

Abstract

L’intestino è la casa del maggior numero di cellule immunitarie nel corpo. Il piccolo e grande sistema immunitario intestinale polizia l’esposizione a antigeni esogeni e modula le risposte a potenti stimoli immunitari microbicamente derivati. Per questo motivo, l’intestino è un importante sito bersaglio di disregolazione immunitaria e infiammazione in molte malattie tra cui, ma, non limitato a malattie infiammatorie intestinali come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, innesto contro l’ospite (GVHD) dopo l’osso trapianto di midollo (BMT), e molte condizioni allergiche e infettive. I modelli Murine di infiammazione gastrointestinale e colite sono pesantemente utilizzati per studiare le complicazioni GI e per ottimizzare pre-clinicamente le strategie per la prevenzione e il trattamento. I dati ricavati da questi modelli attraverso l’isolamento e l’analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall’intestino sono fondamentali per un’ulteriore comprensione immunitaria che può essere applicata per migliorare i disturbi infiammatori gastrointestinali e sistemici. Questo rapporto descrive un protocollo altamente efficace per l’isolamento delle cellule mononucleari (MNC) dal colon utilizzando un’interfaccia mista di gradiente di densità basata sulla silice. Questo metodo isola riproducibilmente un numero significativo di leucociti vitali riducendo al minimo i detriti contaminati, consentendo la successiva fenotipizzazione immunitaria mediante citometria di flusso o altri metodi.

Introduction

Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell’integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale1. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere un delicato equilibrio in cui tollera gli antigeni non patogeni rispondendo in modo appropriato agli antigeni patogeni1,2. Quando l’equilibrio di tolleranza e difesa viene interrotto, localizzato o sistemico immune diregolazione e infiammazione può verificarsi con conseguente una miriade di malattie1,2,3.

L’intestino ospita almeno il 70% di tutte le cellule linfoidi nel corpo4. La maggior parte delle interazioni immunologiche primarie coinvolgono almeno una delle tre stazioni immunitarie dell’intestino: 1) Peyer’s Patches, 2) Linfociti intraeliali (IEL) e 3) linfociti di lamina (LPL). Ognuna di queste è costituita da una complessa rete interconnessa di cellule immunitarie che rispondono rapidamente alle normali sfide immunitarie nell’intestino5. Limitata allo stroma sopra la mucosae muscolosa, la lamina vagamente strutturata propria è il tessuto connettivo della mucosa intestinale e comprende impalcature per il villus, la vascolatura, il drenaggio linfatico e il sistema nervoso mucosale, così come molti e sottoinsiemi immunitari adattivi6,7,8,9. LPL è composto da celluleT CD4 e CD8 in un rapporto approssimativo di 2:1, cellule plasmatiche e cellule di lignaggio mieloidi tra cui, cellule dendritiche, mastociti, eosinofili e macrofagi6.

C’è un crescente interesse nella comprensione della disregolazione immunitaria e dell’infiammazione dell’intestino in quanto si prova per vari stati di malattia. Tali condizioni come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa manifestano tutti diversi livelli di infiammazione colonica10,11,12. Inoltre, i pazienti con disturbi maligni o non maligni del midollo o del sistema immunitario sottoposti a trapianto di midollo osseo allogenico (allo-BMT) possono sviluppare varie forme di colite, tra cui 1) tossicità diretta da regimi condizionanti prima del BMT, 2) infezioni causate dall’immunosoppressione dopo BMT e 3) malattia di innesto-contro-ospite (GVHD) causata da cellule T di tipo donatore che reagiscono agli allogenesti donatori nei tessuti dopo BMT13,14,15. Tutte queste complicazioni post-BMT provocano alterazioni significative nell’ambiente immunitario dell’intestino16,17,18. Il metodo proposto consente una valutazione affidabile dell’accumulo di cellule immunitarie nel colon del topo e, quando applicato ai destinatari murini dopo BMT, facilita un saggio efficiente delle cellule donatrici e immunitarie riceventi coinvolte nella tolleranza deitrapianti 19 ,20. Ulteriori cause di infiammazione intestinale includono malignità, allergie alimentari, o interruzione del microbioma intestinale. Questo protocollo consente l’accesso alle cellule mononucleari intestinali dal colon e, con modifiche, ai leucociti dell’intestino tenue in uno di questi modelli murini preclinici.

Una ricerca PubMed usando i termini di ricerca “intestine e cellule immunitarie e isolamento” rivela oltre 200 pubblicazioni che descrivono i metodi per la digestione dell’intestino tenue per estrarre le cellule immunitarie. Tuttavia, una ricerca simile alla letteratura per il colon non produce protocolli ben delineati che specificano l’isolamento delle cellule immunitarie dal colon. Questo può essere perché il colon ha strati più muscolari e interstiziali, rendendo più difficile da digerire completamente rispetto all’intestino tenue. A differenza dei protocolli esistenti, questo protocollo utilizza specificamente Collagenase E di Clostridium histolyticum senza altre collagene batteriche (Collagenase D/ Collagenase I). Dimostriamo che, utilizzando questo protocollo, la digestione del tessuto colonico può essere raggiunta preservando la qualità delle cellule immunitarie mononucleari dell’intestino isolate (MNC) senza l’aggiunta di reagenti anti-agglomeranti come il versinato di sodio (EDTA), diSpase II e deoxyribonuclease I (DNasie I)21,22,23. Questo protocollo è ottimizzato per consentire l’estrazione robusta riproducibile di MNC vitale dal colon murino per ulteriori studi diretti e dovrebbe prestarsi allo studio dell’immunologia del colon o (con modifiche) dell’intestino tenue24, 25.

Protocol

Tutti gli studi sono stati condotti nell’ambito di protocolli di ricerca sui roditori esaminati e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Miami Miller School of Medicine, che soddisfa gli standard veterinari stabiliti dall’American Association per laboratorio di scienza animale (AALAS). 1. Preparazione delle soluzioni Come descritto nella Tabella 1, preparare il buffer del colon, il supporto di separazione della densità basata …

Representative Results

Quando si lavora con modelli di malattia del colon murino, è utile essere in grado di quantificare e valutare qualitativamente, tra il MNC del colon, più sottoinsiemi di cellule immunitarie coinvolti nel processo infiammatorio. La sospensione a singola cellula di MNC ottenuta attraverso l’applicazione di questo protocollo facilita tale caratterizzazione fenotipica in modo robusto e riproducibile. Come prova di principio per l’applicazione di questo metodo di isolamento in diverse impost…

Discussion

Questo protocollo visivo descrive metodi ben tollerati per l’isolamento delle cellule mononucleari coloniche, tra cui i linfociti propria di lamina (LPL). Dato che questo protocollo è stato ottimizzato nella valutazione di modelli di colite murina pre-trapianto in cui le citochine infiammatorie e le lesioni tissutali si prestano alla scarsa redditività della MNC recuperata, prevediamo che questi metodi possono essere tradotti in altri applicazioni che richiedono l’analisi fenotipica del MNC colonico. Questi includono, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), e dalla Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). I topi C57BL/6 e BALB/c utilizzati in questo studio sono stati allevati nella nostra struttura o forniti da Jackson Labs o Taconic.

Materials

60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10mL Syringe Becton Dickinson 302995
15mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18- gauge Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 micrometer pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

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Cite This Article
McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

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