コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞
Summary
このプロトコルの目的は、コラゲナーゼを用いて組織の酵素消化によって結腸のラミナプロプリに存在する単核細胞を単離させることである。このプロトコルは、単核細胞の効率的な単核分離を可能にし、その結果、単一細胞懸濁液を生成し、堅牢な免疫表現型に使用することができます。
Abstract
腸は、体内の免疫細胞の最大数に家です。小規模および大規模な腸内免疫系は、外因性抗原への暴露を警察し、強力な微生物由来の免疫刺激に対する応答を調節する。このため、腸は、クローン病や潰瘍性大腸炎、骨後の移植片対宿主病(GVHD)などの炎症性腸疾患に限定されない多くの疾患における免疫調節および炎症の主要な標的部位である。骨髄移植(BMT)、および多くのアレルギーおよび感染性状態。消化管炎症および大腸炎のマウスモデルは、GI合併症を研究し、予防と治療のための前臨床最適化戦略に多く使用されています。これらのモデルから収集されたデータは、腸からの免疫細胞の単離および発型分析を介して収集され、消化管および全身性炎症性疾患を改善するために適用することができるさらなる免疫理解に不可欠である。本報告では、混合シリカベースの密度勾配界を用いて結腸から単核細胞(MNC)を単核細胞(MNC)を単離するための非常に有効なプロトコルについて述べている。この方法は、汚染された破片を最小限に抑えながら、かなりの数の生存性白血病を再現可能に分離し、その後の血流サイトメトリーまたは他の方法による免疫表現型を可能にする。
Introduction
消化管(GI)管は主に食物からの栄養素の処理と再吸収に専念していますが、GI管はまた、血管、リンパ系、神経系および他の多くの器官の完全性において中心的な役割を維持しています。その粘膜および粘膜下免疫システム1.GI免疫システムは、食品、共生細菌、または侵入病原体1、2からの外来抗原への絶え間ない暴露による消化管および全身の健康の両方に影響力のある役割を有する。したがって、GI免疫系は、病原性抗原1、2に適切に応答しながら非病原性抗原に許容する微妙なバランスを維持しなければならない。耐性と防御のバランスが崩れると、局所的または全身性免疫不自由および炎症が起こり得る1、2、3の無数の疾患をもたらす。
腸は、体内のすべてのリンパ球の少なくとも70%を収容する4.ほとんどの一次免疫相互作用は、腸内の3つの免疫局の少なくとも1つを含む:1)ペイヤーのパッチ、2)上皮内リンパ球(IEL)および3)ラミナプロプリアリンパ球(LPL)。これらの各々は、腸内の正常な免疫課題に迅速に応答する免疫細胞の複雑な相互接続されたネットワークで構成されています5.筋粘膜上の間質に制限され、緩やかに構造化されたラミナプロプリアは腸粘膜の結合組織であり、絨毛、血管系、リンパ液の排液、粘膜神経系、ならびに多くの自然の足場を含む。および適応免疫サブセット6,7,8,9.LPLは、CD4+およびCD8+T細胞を2:1の近似比で構成し、血漿細胞および骨髄系統細胞、樹状細胞、マスト細胞、好酸球およびマクロファージ6を含む。
様々な疾患状態に関連する腸の免疫不調と炎症を理解することに対する関心が高まっています。クローン病および潰瘍性大腸炎のような状態はすべて、大腸炎症10、11、12の様々なレベルを現す。さらに、同種骨髄移植(allo-BMT)を受ける骨髄または免疫系の悪性または非悪性障害を有する患者は、1)コンディショニングレジメンからの直接的な毒性を含む様々な形態の大腸炎を発症する可能性がある。BMTの前に、2)BMTおよび3)BMT後の免疫抑制によって引き起こされる感染症および3)BMT13、14、15の後に組織内のドナー・アロ抗原に反応するドナー型T細胞によって駆動される移植片対宿主病(GVHD)。これらすべてのポストBMT合併症は、腸16、17、18の免疫環境に有意な変化をもたらす。提案された方法は、マウス結腸における免疫細胞蓄積の信頼できる評価を可能にし、BMT後のマウスレシピエントに適用すると、移植耐性に関与するドナーおよびレシピエント免疫細胞の両方の効率的なアッセイを容易にする19 、20.腸の炎症の追加の原因は、悪性腫瘍、食物アレルギー、または腸内微生物叢の破壊が含まれます。このプロトコルは、結腸からの腸単核細胞のアクセスを可能にし、修飾して、これらの前臨床マウスモデルのいずれかで小腸の白血球にアクセスする。
検索語「腸と免疫細胞と分離」を用いたPubMed検索は、免疫細胞を抽出するための小腸消化の方法を記述する200以上の出版物を明らかにする。しかし、コロンの同様の文献検索では、結腸からの免疫細胞の単離を指定する十分に記述されたプロトコルは得られなかった。これは、結腸がより筋肉と間質の層を持っているので、小腸よりも完全に消化するのが難しいからかもしれません。既存のプロトコルとは異なり、このプロトコルは、特に他の細菌性コラゲナーゼ(コラゲナーゼD/コラゲナーゼI)なしでクロストリジウム内素体からコラゲナーゼEを使用します。我々は、このプロトコルを用いて、ナトリウムversenate(EDTA)、ディスパーゼIIなどの抗束試薬を添加することなく、単核免疫細胞(MNC)の単核免疫細胞の品質を維持しながら、大腸組織の消化を達成できることを実証する。デオキシリボヌクレアーゼI(DNAse I)21、22、23.このプロトコルは、さらなる指示された研究のためにマウス結腸から生存可能なMNCの再現可能な堅牢な抽出を可能にするために最適化され、コロンの免疫学の研究または(修飾を伴う)小腸24、25.
Protocol
Representative Results
Discussion
この視覚プロトコルは、ラミナプロプリアリンパ球(LPL)を含む大腸単核細胞の単核細胞の単離のための十分に許容される方法を説明する。このプロトコルは、炎症性サイトカインおよび組織損傷が回収されたMNCの生存率の低下に自分自身を貸し出す重度の移植後マウス大腸炎モデルの評価に最適化されたことを考えると、これらの方法は他の方法に翻訳できると予想される結腸MNCのフェオテ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、助成金#1K08HL088260と#1R01HL133462-01A1(A.B.P.、H.N.、S.J.)、および小児研究のためのバチェラー財団(D.M.、H.N.、S.J.、A.A.H.、A.B.P.)によって支援されました。本研究で使用したC57BL/6およびBALB/cマウスは、当施設で飼育されるか、ジャクソン・ラボまたはタコニックによって提供された。
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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