Summary

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Published: August 31, 2019
doi:

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la generación espontánea de neuroesferas enriquecidas en células progenitoras neuronales a partir de neuronas chapadas de alta densidad. Durante el mismo experimento, cuando las neuronas se platean a una densidad más baja, el protocolo también resulta en cultivos prolongados de neuronas de rata primaria.

Abstract

El cultivo de neuronas primarias es una técnica esencial en el campo de la neurociencia. Para obtener una visión mecanicista más profunda en el cerebro, es esencial tener un modelo in vitro robusto que pueda ser explotado para varios estudios de neurobiología. Aunque los cultivos de neuronas primarias (es decir, cultivos hipocampales a largo plazo) han proporcionado a los científicos modelos, todavía no representa la complejidad de la red cerebral por completo. A raíz de estas limitaciones, un nuevo modelo ha surgido utilizando las neuroesferas, que tiene un parecido más cercano al tejido cerebral. El presente protocolo describe el revestimiento de altas y bajas densidades de neuronas corticales e hipocampales mixtas aisladas del embrión de ratas embrionarias del día 14-16 de Sprague Dawley. Esto permite la generación de neuroesferas y cultivo de neuronas primarias a largo plazo como dos plataformas independientes para llevar a cabo más estudios. Este proceso es extremadamente simple y rentable, ya que minimiza varios pasos y reactivos que anteriormente se consideraban esenciales para el cultivo de neuronas. Este es un protocolo robusto con requisitos mínimos que se pueden realizar con resultados alcanzables y más utilizado para una diversidad de estudios relacionados con la neurociencia.

Introduction

El cerebro es un circuito intrincado de células neuronales y no neuronales. Durante años, los científicos han estado tratando de obtener información sobre esta compleja maquinaria. Para ello, los neurocientíficos recurrieron inicialmente a varias líneas celulares transformadas basadas en los nervios para las investigaciones. Sin embargo, la incapacidad de estas líneas celulares clonales para formar fuertes conexiones sinápticasy axones o dendritas adecuadas han desplazado el interés científico a los cultivos de neuronas primarias 1,2. El aspecto más emocionante de la cultura de neuronas primarias es que crea una oportunidad para observar y manipular las neuronas vivas3. Además, es menos complejo en comparación con el tejido neural, lo que lo convierte en un candidato ideal para estudiar la función y el transporte de varias proteínas neuronales. Recientemente, varios desarrollos en los campos de la microscopía, la genómica y la proteómica han generado nuevas oportunidades para que los neurocientíficos exploten las culturas de las neuronas4.

Las culturas primarias han permitido a los neurocientíficos explorar los mecanismos moleculares detrás del desarrollo neuronal, analizar varias vías de señalización neuronal y desarrollar una comprensión más coherente de la sinapsis. Aunque una serie de métodos han reportado cultivos de neuronas primarias (principalmente del origen del hipocampo5,6,7), un protocolo unificado con un medio definido químicamente que permite el cultivo a largo plazo de las neuronas es todavía es necesario. Sin embargo, las neuronas plateadas a una baja densidad se observan con mayor frecuencia, que no sobreviven a largo plazo, probablemente debido a la falta de soporte trófico8 que es proporcionado por las neuronas adyacentes y células gliales. Algunos métodos incluso han sugerido la co-cultura de las neuronas primarias con célulasgliales, donde las células gliales se utilizan como una capa de alimentación 9. Sin embargo, las células gliales plantean muchos problemas debido a su crecimiento excesivo, que a veces anulan el crecimiento neuronal10. Por lo tanto, teniendo en cuenta los problemas anteriores, se requiere un protocolo de cultivo neural primario más simple y rentable, que puede ser utilizado por neurobiólogos y neuroquímicos para investigaciones.

Un cultivo de neurona primaria es esencialmente una forma de cultivo 2D y no representa la plasticidad, integridad espacial o heterogeneidad del cerebro. Esto ha dado lugar a la necesidad de un modelo 3D más creíble llamado neuroesferas11,12. Las neuroesferas presentan una plataforma novedosa para los neurocientíficos, con un parecido más cercano al cerebro real, in vivo13. Las neuroesferas son grupos 3D no adherentes de células que son ricas en células madre neurales (NSC), células progenitoras neuronales (NPC), neuronas y astrocitos. Son una excelente fuente para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neuronales, que se pueden utilizar para estudiar la diferenciación en varios linajes neuronales y no neuronales. Una vez más, la variabilidad dentro de los cultivos de la neuroesfera producidos utilizando los protocolos reportados anteriormente presenta una barrera a la formulación de un protocolo unificado de cultivo de la neuroesfera14.

Este manuscrito presenta un protocolo en el que es posible generar plataformas 2D y 3D alternando densidades de chapado celular a partir de un cultivo cortical e hipocampal mixto. Se observa que en un plazo de 7 días, las neuroesferas flotantes se obtienen de neuronas chapadas de alta densidad aisladas del embrión de rata Sprague Dawley E14-E16, que tras un cultivo posterior, forman puentes e interconexiones a través de extensiones radiales de tipo glial. Del mismo modo, en las neuronas chapadas de baja densidad, se obtiene un cultivo de neuronas primarias que se pueden mantener hasta 30 días cambiando el medio de mantenimiento dos veces por semana.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales relacionados con el animal fueron aprobados por el Comité Institucional de etica animal del CSIR-Instituto Indio de Biología Química (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1). 1. Preparación de reactivos y medios Solución de poli-d-lisina (PDL): preparar soluciones PDL a concentraciones de 0,1 mg/ml en agua desionizada y almacenar en 4oC hasta su uso. Medio de disociación: A 1 L de agua estéril desionizada filtrada, combinar los siguientes…

Representative Results

En este protocolo, se ha aclarado una estrategia simple en la que se obtienen densidades de chapado de células variables de dos plataformas de cribado neuronal diferentes. Figura 1A,B ilustra la adherencia de las células después de 4 h de chapado de las neuronas en células chapadas de alta y baja densidad, respectivamente. Al observar la correcta adherencia de las neuronas como se muestra en la Figura 1, el m…

Discussion

Este protocolo describe que cómo al alterar las densidades de revestimiento celular de las neuronas primarias, se obtienen dos plataformas neuronales variables. Aunque se trata de un método sencillo, cada paso debe realizarse meticulosamente para lograr los resultados deseados. Otros métodos anteriores han reportado cultivos de neuronas primarias a largo plazo o cultivos de neuroesfera. La mayoría de los protocolos de cultivo de neuronas primarias han implicado el cultivo de neuronas hipocampales durante 3-5 semanas,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a las instalaciones para animales del CSIR-IICB. G. D. agradece a ICMR, J. K. y V. G. agradecen a DST Inspire, y a D. M. gracias dbT, India por sus becas. S. G. reconoce amablemente a SERB (EMR/2015/002230) India por proporcionar apoyo financiero.

Materials

Anti-GFAP Abcam AB7260
Anti- Nestin Abcam AB92391
Anti-O4 Millipore MAB345
Anti-Tau Abcam AB76128
Anti-Tuj1 Millipore MAB1637
B27 Serum Free Supplement  Gibco 17504-044
Cell Counter Life technologies Countess II FL
CO2 Incubator Eppendorf Galaxy 170 R
D-glucose  SDFCL 38450-K05
Ethanol Merck Millipore 100983
Fluorescence Microscope Olympus IX83 Model
Formaldehyde Sigma Aldrich 47608
GlutaMax-I Supplement Gibco 35050-061
GtXMs IgG Fluor Millipore AP1814
GtXMs IgG (H+L) Millipore AP124C
HEPES SRL 16826
Hoechst 33258 Calbiochem 382061
Horse Serum  HiMedia RM10674
Hydrochloric Acid Rankem H0100
Laminar Hood BioBase BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS  Sigma Aldrich M-2279
Microscope Dewinter Victory Model
Neurobasal Medium  Gibco 21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) BD Falcon 353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes Himedia PW001
Penicillin/Streptomycin  Gibco 15140-122
Poly-D-Lysine Millipore A.003.E
Potassium Chloride  Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic  Merck MI6M562401
Sodium Chloride  Qualigem 15918
Sodium Phosphate Dibasic  Merck MI6M562328
Stereomicrosope Dewinter Zoomstar Model
Triton-X 100 SRL 2020130
Trypan Blue Solution Gibco 15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072

References

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Das, G., Gupta, V., Khan, J., Mukherjee, D., Ghosh, S. Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo. J. Vis. Exp. (150), e59800, doi:10.3791/59800 (2019).

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