Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

De hersenen is een ingewikkelde circuits van neuronale en niet-neuronale cellen. Al jaren proberen wetenschappers inzicht te verwerven in deze complexe machines. Om dit te doen, neurowetenschappers aanvankelijk toevlucht genomen tot verschillende getransformeerde zenuw-gebaseerde cellijnen voor onderzoeken. Echter, het onvermogen van deze klonale cellijnen om sterke synaptische verbindingen en goede axonen of dendrites te vormen hebben de wetenschappelijke belangstelling verschoven naar primaire neuron culturen^1,2. Het meest opwindende aspect van de primaire neuron cultuur is dat het een kans creëert om levende neuronen³te observeren en te manipuleren. Bovendien, het is minder complex in vergelijking met zenuwweefsel, waardoor het een ideale kandidaat voor het bestuderen van de functie en het vervoer van verschillende neuronale eiwitten. Onlangs hebben verschillende ontwikkelingen op het gebied van microscopie, Genomics en proteomica nieuwe mogelijkheden voor neurowetenschappers opgeleverd om neuron culturen⁴te exploiteren.

Primaire culturen hebben neurowetenschappers toegestaan om de moleculaire mechanismen achter neurale ontwikkeling te verkennen, verschillende neurale signalerings trajecten te analyseren en een meer samenhangend begrip van Synapsis te ontwikkelen. Hoewel een aantal methoden hebben gerapporteerd culturen van primaire neuronen (meestal uit de hippocampal oorsprong^5,6,7), een uniform protocol met een chemisch gedefinieerd medium dat de lange termijn cultuur van neuronen maakt is nog steeds nodig. Echter, neuronen verguld met een lage dichtheid worden meestal waargenomen, die niet overleven op lange termijn, waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan trofische ondersteuning⁸ die wordt geleverd door de aangrenzende neuronen en gliacellen. Sommige methoden hebben zelfs voorgesteld co-culturing van de primaire neuronen met gliacellen, waarbij de gliacellen worden gebruikt als een feeder Layer⁹. Echter, gliacellen vormen een heleboel problemen als gevolg van hun overmatige groei, die soms de neuronale groei¹⁰overschrijven. Vandaar, gezien de bovenstaande problemen, een eenvoudigere en meer kosteneffectieve primaire neurale cultuur protocol is vereist, die kan worden gebruikt door zowel neuro biologen en neuro chemici voor onderzoeken.

Een primaire neuron cultuur is in wezen een vorm van 2D cultuur en vertegenwoordigt niet de plasticiteit, ruimtelijke integriteit, of heterogeniteit van de hersenen. Dit heeft aanleiding gegeven tot de noodzaak van een geloofwaardiger 3D-model genaamd neuro sferen^11,12. Neuro sferen presenteren een nieuw platform aan neurowetenschappers, met een nauwere gelijkenis met de echte, in vivo hersenen¹³. Neuro sferen zijn niet-aanhankelijke 3D-clusters van cellen die rijk zijn aan neurale stamcellen (NSCs), neurale voorlopercellen (Npc’s), neuronen en astrocyten. Ze zijn een uitstekende bron voor de isolatie van neurale stamcellen en neurale voorlopercellen, die kunnen worden gebruikt om differentiatie te bestuderen in verschillende neuronale en niet-neuronale kilometerstanden. Opnieuw, variabiliteit binnen neurosphere culturen geproduceerd met behulp van de eerder gerapporteerde protocollen presenteert een barrière voor de formulering van een uniforme neurosphere Culture protocol¹⁴.

Dit manuscript presenteert een protocol waarin het mogelijk is om zowel 2D-als 3D-platforms te genereren door de dichtheden van celplating te wisselen van een gemengde corticale en hippocampal-cultuur. Het is waargenomen dat binnen 7 dagen vrij-zwevende neuro sferen worden verkregen uit hoge dichtheid vergulde neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo, die bij verdere cultuur, vormen bruggen en interconnecties door middel van radiale glial-achtige extensies. Evenzo, in de lage dichtheid vergulde neuronen, een primaire neuron cultuur die kan worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen wordt verkregen door het wijzigen van het onderhouds medium twee keer per week.