Separación de la epidermis y la dermis de rata con termoisina para detectar ARNm y proteínas inflamatorias específicas del sitio
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la separación de la epidermis de la dermis para evaluar la producción de mediadores inflamatorios. Después de la inflamación, la epidermis de la pata trasera de la rata se separa de la dermis por termolisis a 4 ° C. La epidermis se utiliza para el análisis de ARNm por RT-PCR y la evaluación de proteínas por western blot e inmunohistoquímica.
Abstract
Se necesitan técnicas fáciles de usar y económicas para determinar la producción específica del sitio de mediadores inflamatorios y neurotrofinas durante lesiones cutáneas, inflamación y / o sensibilización. El objetivo de este estudio es describir un protocolo de separación epidérmica-dérmica utilizando termolisina, una proteinasa que está activa a 4 °C. Para ilustrar este procedimiento, las ratas Sprague Dawley son anestesiadas, y las patas traseras derechas se inyectan con carragenina. Seis y doce horas después de la inyección, las ratas con inflamación y las ratas ingenuas son sacrificadas, y un trozo de pata trasera, piel glabra se coloca en el medio de águila modificada de Dulbecco frío. La epidermis se separa en la membrana basal de la dermis por termolisis en PBS con cloruro de calcio. A continuación, la dermis está asegurada por pórceps de microdisección, y la epidermis se elimina suavemente. La tinción azul toluidina de las secciones de tejido muestra que la epidermis se separa limpiamente de la dermis en la membrana basal. Todas las capas de células de queratinocitos permanecen intactas, y las crestas de rete epidérmicas junto con las hendiduras de las papilas dérmicas se observan claramente. La RT-PCR cualitativa y en tiempo real se utiliza para determinar el factor de crecimiento nervioso y los niveles de expresión de interleucina-6. Western blotting e inmunohistoquímica finalmente se realizan para detectar cantidades de factor de crecimiento nervioso. Este informe ilustra que la digestión con termoisina fría es un método eficaz para separar la epidermis de la dermis para la evaluación de las alteraciones del ARNm y las proteínas durante la inflamación.
Introduction
La evaluación de mediadores inflamatorios y factores neurotróficos de la piel puede ser limitada debido a la heterogeneidad de los tipos celulares que se encuentran en la dermis inflamada y la epidermis1,2,3. Recientemente se han revisado varias enzimas, técnicas químicas, térmicas o mecánicas que implican la separación de las dos capas o para realizar la disociación celular para su evaluación4. El ácido, el álcali, la sal neutra y el calor pueden dividir la epidermis de la dermis rápidamente, pero la hinchazón celular y extracelular a menudo ocurre5,6. La tripsina, la pancreatina, la elastasa, la queratinasa, la colagenasa, la pronasa, la dispasa y la termolisina son enzimas que se han utilizado para la separación epidérmica-dérmica4,7. La tripsina y otras enzimas proteolíticas a gran escala están activas a 37-40 °C, pero deben controlarse cuidadosamente para evitar la disociación de las capas epidérmicas. Dispase escinde la epidermis en la lámina densa, pero requiere 24 h para la separación en los puntos fríosde 4,8 o menos tiempo a 37 °C4,9. Una característica limitante de todas estas técnicas es la posible alteración de la morfología tisular y la pérdida de integridad del ARNm y la proteína.
Para mantener la integridad del ARNm y la proteína, se debe llevar a cabo un método de separación de la piel en el frío durante un corto período de tiempo. En la evaluación de técnicas de separación de la piel para estudios de inflamación, la termoisina es una enzima eficaz para separar la epidermis de la dermis a temperaturas frías4. La termoisina es activa a 4 °C, escinde los hemidesmosomas epidérmicos de la lámina lúcida y separa la epidermis de la dermis en 1–3 h4,8,10. El objetivo de este informe es optimizar el uso de termolysin para la separación de la epidermis de rata inflamada de la dermis para detectar los niveles de ARNm y proteínas para mediadores inflamatorios y factores neurotróficos. Se han presentado varios informes preliminares11,12,13,14,15. El objetivo de este manuscrito es describir una técnica óptima de separación cutánea utilizando termolizsina y demostrar la detección de 1) marcadores de inflamación, 2) ARNm de interleucina-6 (IL-6) y 3) ARNm y proteína del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la epidermis de ratas con inflamación inducida por carragenina (C-II)16,17. Un informe preliminar utilizando el modelo adyuvante completo de Freund indica que los niveles de ARNm y proteínas ngf aumentan temprano durante la inflamación15. En ratones, la sensibilización cutánea con la aplicación tópica de oxazolona provoca un aumento precoz del ARNm IL-6 mediante hibridación in situ36. Tanto la IL-6 como la NGF se han implicado en C-II18,19,pero no ha habido informes que describan los niveles de ARNm o proteína para IL-6 o NGF específicamente de la epidermis durante las etapas agudas de C-II.
La técnica de termolysin es barata y fácil de realizar. Además, la separación termolisina de la epidermis de la dermis permite el ARNm, el western blot y el análisis inmunohistoquímico de mediadores inflamatorios y factores neurotróficos durante el proceso de inflamación15. Los investigadores deben poder utilizar fácilmente esta técnica en estudios preclínicos y clínicos de inflamación de la piel.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio determinó que la epidermis de la piel glabra de la pata trasera de la rata se separó fácilmente de la dermis utilizando termoisina (0,5 mG / ml) en PBS con 1 mM de cloruro de calcio a 4 ° C durante 2,5 h. La evaluación histológica indicó que la epidermis estaba separada de la dermis en la membrana basal y que las crestas de la rete epidérmica estaban intactas. La termolisina es una metaloendopeptidasa extracelular producida por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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