Séparation de l’épiderme et du derme du rat avec la thermolysine pour détecter l’ARNm et la protéine inflammatoires spécifiques au site
Summary
Présenté ici est un protocole pour la séparation de l’épiderme du derme pour évaluer la production de médiateur inflammatoire. Suite à l’inflammation, l’épiderme de la patte postérieure du rat est séparé du derme par la thermolysine à 4 °C. L’épiderme est ensuite utilisé pour l’analyse de l’ARNm par RT-PCR et l’évaluation des protéines par transfert de Western et immunohistochimie.
Abstract
Des techniques faciles à utiliser et peu coûteuses sont nécessaires pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de lésions cutanées, d’inflammation et / ou de sensibilisation. L’objectif de cette étude est de décrire un protocole de séparation épidermique-cutanée utilisant la thermolysine, une protéinase active à 4 °C. Pour illustrer cette procédure, les rats Sprague Dawley sont anesthésiés et les pattes postérieures droites sont injectées avec du carraghénane. Six et douze heures après l’injection, des rats souffrant d’inflammation et des rats naïfs sont euthanasiés, et un morceau de patte postérieure, la peau glabre est placé dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco froid. L’épiderme est ensuite séparé au niveau de la membrane basale du derme par thermolysine dans le PBS avec du chlorure de calcium. Ensuite, le derme est sécurisé par des pinces à microdissection et l’épiderme est doucement taquiné. La coloration bleu toluidine des coupes de tissu montre que l’épiderme est séparé proprement du derme au niveau de la membrane basale. Toutes les couches de cellules kératinocytes restent intactes et les crêtes épidermiques ainsi que les indentations des papilles dermiques sont clairement observées. La RT-PCR qualitative et en temps réel est utilisée pour déterminer le facteur de croissance nerveuse et les niveaux d’expression de l’interleukine-6. Le western blotting et l’immunohistochimie sont enfin effectués pour détecter des quantités de facteur de croissance nerveuse. Ce rapport illustre que la digestion froide par thermolysine est une méthode efficace pour séparer l’épiderme du derme pour l’évaluation des altérations de l’ARNm et des protéines pendant l’inflammation.
Introduction
L’évaluation des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques de la peau peut être limitée en raison de l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans le derme et l’épiderme enflammés1,2,3. Plusieurs enzymes, techniques chimiques, thermiques ou mécaniques impliquant la séparation des deux couches ou permettant d’effectuer une dissociation cellulaire pour évaluation ont été revues récemment4. L’acide, l’alcali, le sel neutre et la chaleur peuvent séparer rapidement l’épiderme du derme, mais un gonflement cellulaire et extracellulaire se produit souvent5,6. La trypsine, la pancréatine, l’élastase, la kératinase, la collagénase, la pronase, la dispase et la thermolysine sont des enzymes qui ont été utilisées pour la séparation épidermique-cutanée4,7. La trypsine et d’autres enzymes protéolytiques à grande échelle sont actives à une °C de 37 à 40 °C, mais doivent être surveillées attentivement pour éviter la dissociation des couches épidermiques. Dispase clive l’épiderme à la lamina densa, mais nécessite 24 h pour la séparation dans le froid4,8 ou des points de temps plus courts à 37 ° C4,9. Une caractéristique limitante de toutes ces techniques est la perturbation potentielle de la morphologie des tissus et la perte d’intégrité de l’ARNm et des protéines.
Pour maintenir l’intégrité de l’ARNm et des protéines, une méthode de séparation de la peau doit être effectuée dans le froid pendant une courte période de temps. Dans l’évaluation des techniques de séparation de la peau pour les études sur l’inflammation, la thermolysine est une enzyme efficace pour séparer l’épiderme du derme à des températures froides4. La thermolysine est active à 4 °C, coupe les hémidesmosomes épidermiques de la lamina lucida et sépare l’épiderme du derme en 1–3 h4,8,10. L’objectif de ce rapport est d’optimiser l’utilisation de la thermolysine pour séparer l’épiderme enflammé du rat du derme afin de détecter les niveaux d’ARNm et de protéines pour les médiateurs inflammatoires et les facteurs neurotrophiques. Plusieurs rapports préliminaires ont étéprésentés11,12,13,14,15. L’objectif de ce manuscrit est de décrire une technique optimale de séparation de la peau à l’aide de la thermolysine et de démontrer la détection de 1) marqueurs de l’inflammation, 2) ARNm interleukine-6 (IL-6) et 3) ARNm et protéines du facteur de croissance nerveuse (NGF) dans l’épiderme de rats présentant une inflammation induite par le carraghénane (C-II)16,17. Un rapport préliminaire utilisant le modèle adjuvant complet de Freund indique que les niveaux d’ARNm et de protéines NGF augmentent tôt pendant l’inflammation15. Chez la souris, la sensibilisation cutanée avec l’application topique d’oxazolone provoque une augmentation précoce de l’ARNm IL-6 en utilisant l’hybridation in situ36. L’IL-6 et le NGF ont tous deux été impliqués dans C-II18,19, mais il n’y a eu aucun rapport décrivant les niveaux d’ARNm ou de protéines pour l’IL-6 ou le NGF spécifiquement de l’épiderme pendant les stades aigus de C-II.
La technique de la thermolysine est peu coûteuse et simple à réaliser. De plus, la séparation thermolysine de l’épiderme du derme permet l’ARNm, le transfert de Western et l’analyse immunohistochimique des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques au cours du processus d’inflammation15. Les investigateurs devraient être en mesure d’utiliser facilement cette technique dans les études précliniques et cliniques de l’inflammation de la peau.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude a déterminé que l’épiderme de la peau glabre de la patte postérieure du rat était facilement séparé du derme à l’aide de la thermolysine (0,5 mG / mL) dans le PBS avec 1 mM de chlorure de calcium à 4 ° C pendant 2,5 h. L’évaluation histologique a indiqué que l’épiderme était séparé du derme au niveau de la membrane basale et que les crêtes épidermiques étaient intactes. La thermolysine est une métalloendopeptidase extracellulaire produite parBacillus thermoproteolyticus<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de cette recherche a été fourni par les National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
