Summary

Количественная флуоресценция в ситу Гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (ИФ) специфических генных продуктов в KSHV-зараженных клетках

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Мы описываем протокол с использованием флуоресценции на месте гибридизации (FISH) для визуализации нескольких герпесвиральных РНК в литически инфицированных человеческих клеток, либо в подвеске или приверженцев. Этот протокол включает в себя количественную оценку флуоресценции, производящей нуклеоцитоплазмическое соотношение и может быть расширен для одновременной визуализации принимающих и вирусных белков с иммунофлуоресценцией (ИФ).

Abstract

Механистический анализ приходит из тщательного изучения и количественной оценки конкретных РНК и белков. Относительное расположение этих биомолекул по всей клетке в определенное время может быть захвачено с флуоресценцией на месте гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (IF). Во время литической герпесвирусной инфекции вирус захватывает клетку-хозяина, чтобы преимущественно выражать вирусные гены, вызывая изменения в морфологии клеток и поведении биомолекул. Литические деятельности сосредоточены на ядерных заводах, называется вирусных репликации отсеков, которые заметны только с FISH и IF. Здесь мы описываем адаптируемый протокол РНК FISH и IF методы для Саркомы Апоши связанных герпесвирус (KSHV) инфицированных клеток, как приверженцев и в подвеске. Метод включает в себя шаги по разработке специфических антисмысловых олигонуклеотидов, двойной РНК FISH, РНК FISH с IF, а также количественные расчеты интенсивности флуоресценции. Этот протокол был успешно применен к нескольким типам клеток, неинфицированных клеток, скрытых клеток, литических клеток, временных курсов и клеток, обработанных ингибиторами для анализа пространственно-временной деятельности конкретных РНК и белков как от хозяина человека, так и КШВ.

Introduction

В их литической (активной) фазе, герпесвирусы захватывают клетку-хозяина, вызывая изменения в морфологии клеток и локализации биологических молекул, для производства вирионов. Основой операций является ядро, где двухцепочечный геном ДНК вирусного реплицируется и упакован в белковую оболочку, называемую капсидом1. Для начала вирус выражает свои собственные белки, угон принимающей машины и предотвращения экспрессии несущественных генов хозяина, процесс, называемый эффект выключения хозяина. Большая часть этой деятельности локализована на конкретные 4 “,6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) свободных ядерных регионов, называемых вирусных репликации отсеков, состоящий из как принимающих и вирусных белков, РНК, и вирусной ДНК2. Ячейка капитально отремонтирована, чтобы обеспечить пространство и ресурсы для репликации отсеков и, таким образом, сборки вирусных капсидов. После того, как капсид выходит из ядра, как капсид окутан цитоплазмой для производства мембраны связанных вирусной частицы, также известный как вирион, неясно. Понимание локализации и пространственных сдвигов как хоста, так и вирусных биомолекул во время литической фазы обеспечивает более глубокое механистическое понимание расположения отсека репликации, эффекта выключения хозяина, пути выхода из virиона и других процессов, связанных с герпесвирусной инфекцией и репликацией.

В настоящее время лучшим методом обнаружения и изучения этих изменений является визуализация белков и РНК в инфицированных клетках с иммунофлуоресценцией (ИФ) и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH), соответственно. Использование временного курса с помощью этих методов показывает локализацию биомолекул в ключевых точках литической фазы или просто пространственно-временных данных. FISH и IF дополняют другие биохимические методы, такие как ингибирование клеточного процесса (например, ингибирование репликации вирусной ДНК), RT-qPCR (цепная реакция полимеразы в реальном времени), секвенирование РНК, северные помарки, масс-спектрометрия, западная блоттинг и анализ производства вирусной ДНК, который может обеспечить более глобальную картину клеточной деятельности.

Мы разработали стратегии RNA FISH для изучения продуктов РНК из конкретных генов и вычислительного анализа, который количественно вычисляет нуклеоцитоплазмическое соотношение конкретного генного продукта. Подготовка образца, измененная из предыдущих публикаций Steitz и коллегами3,4,относительно проста и может быть использована как для приверженцев, так и для подвесных клеток. Протокол также адаптируется для одновременного использования нескольких стратегий РНК FISH (двойная РНК FISH) или RNA FISH со стратегиями IF. Разработка конкретной стратегии FISH является сложной задачей, но предложения по улучшению успеха изложены. Анализ данных, описанный здесь, является количественным, если используются флуоресцентные бусы и сильные маркеры границ отсека, и дает дополнительное представление о микрографах, понимание, которое устраняет предвзятость наблюдения. Подробный протокол предназначен как для скрытых, так и для литических клеток, инфицированных саркома-ассоциированным герпесвирусом Капоши (KSHV) и может быть использован с неинфицированными клетками или клетками, инфицированными другими герпесвирусами5. Методы количественной оценки применимы к исследованиям по нуклеоцитоплазматическим сдвигам или перелокализации между субклеточными отсеками в большинстве клеток.

Protocol

1. Дизайн флуоресценции на месте (FISH) анти-чувство олигонуклеотидов для обнаружения конкретных герпесвиральных стенограммы Выберите от 25 до 40 nt сегментов из последовательности РНК интерес и конвертировать в анти-чувство. Успешная стратегия FISH может содержать от одного до десяти и…

Representative Results

Методы FISH и IF, описанные в данной рукописи, показаны на рисунке 1 наряду с количественной оценкой результатов по линейным следам флуоресцентной интенсивности. Представленные здесь результаты являются полуколичественными и дают представление о локали…

Discussion

Протокол, описанный в настоящем докладе, может быть адаптирован к различным типам клеток и включает в себя шаги для двойной РНК FISH и RNA FISH с IF с использованием как моноклональных, так и поликлональных первичных антител. Хотя подготовленные слайды, как правило, изображены с конфокальный м…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Джонатана Роденфельса, Казимира Тычовски и Джоанну Б. Уизерс за советы по анализу данных. Мы также благодарим Г. Хейворд за анти-SSB антитела. Эта работа была поддержана грантами T32GM007223 и T32AI055403 от Национальных институтов здравоохранения (для ТКВ) и грантом NIH (CA16038) (для JAS). JAS является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Цифры 1-3 и таблица 1 были воспроизведены с разрешения Американского общества микробиологии под лицензией Creative Commons Attribution из следующей публикации: Валлери, Т. К., Уизерс, Дж.Б., Андо, Дж.А., Штейтц, Саркома-Ассоциированные Дж.А. Капоши Накопление герпесвируса мРНК в ядерной foci зависит от вирусной репликации ДНК и вирусного некодирования полиаденинатной ядерной РНК. В журнале вирусологии. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

Materials

AlexaFluor594-5-dUTP Life Technologies C1100
anti-DIG FITC  Jackson Lab Immunologicals 200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody Invitrogen A-11037 Goat
Anti-SSB Antibody N/A N/A Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn NIH NCBI N/A Free Sequence Alignment Software
Dextran Sulfate Sigma Aldrich D8906 Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit Sigma Roche #03353583910 2nd Gen
Eight-Chamber Slides Nunc Lab Tek II #154453 Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. 
Formamide Sigma Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
GAPDH Probes Stellaris SMF-2019-1 Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ  NIH, Bethesda, MD N/A Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer IDT N/A Free Oligonucleotide Analyzer 
pcDNA3 Invitrogen A-150228
pmaxGFP Amaxa VDF-1012
Poly L-Lysine Sigma Aldrich P8920
Terminal Transferase Sigma Roche #003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes  NEB S1402S
Vectashield Vector Laboratories, Inc.  H-1000 DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. 

References

  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  3. Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
  4. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
  5. Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
  6. Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  9. Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
  10. Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
  11. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  12. Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
  13. Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
  14. Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
  15. Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
  16. Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
  17. Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
  18. Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).

Play Video

Cite This Article
Vallery, T. K., Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (150), e59697, doi:10.3791/59697 (2019).

View Video