Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Em sua fase lítica (ativa), os herpesvírus sequestram a célula hospedeira, causando alterações na morfologia celular e localização de moléculas biológicas, para produzir virions. A base das operações é o núcleo, onde o genoma viral do DNA duplo-encalhado é replicado e empacotado em um escudo da proteína, chamado um capsídeo¹. Para começar, o vírus expressa suas próprias proteínas, seqüestro máquinas hospedeiras e impedindo a expressão de genes de acolhimento não essenciais, um processo denominado o efeito de desligamento do hospedeiro. A maioria desta atividade é localizada a 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-regiões nucleares livres chamadas compartimentos virais da replicação, compreendidos das proteínas do anfitrião e do viral, do RNAs, e do ADN viral². A célula é revisado para fornecer espaço e recursos para os compartimentos de replicação e, portanto, montagem de capsids virais. Uma vez que o capsídeo sai do núcleo, como o capsídeo é envolvido no citoplasma para produzir uma partícula viral ligada à membrana, também conhecida como um virion, não é clara. A compreensão da localização e dos deslocamentos espaciais de ambos os hospedeiros e biomoléculas virais durante a fase lítica fornece uma introspecção mecanicista mais profunda no arranjo do compartimento da duplicação, do efeito do desligamento do anfitrião, da via do virion-saída, e do outro processos relacionados à infecção herpética e à replicação.

Atualmente, o melhor método para detectar e estudar essas alterações é a visualização de proteínas e RNAs em células infectadas com imunofluorescência (IF) e hibridação in situ fluorescente (FISH), respectivamente. O uso de um curso de tempo com essas técnicas revela a localização de biomoléculas em pontos-chave da fase lítica ou simplesmente, dados espaciotemporais. FISH e IF complementam outras técnicas bioquímicas, como a inibição de um processo celular (por exemplo, inibição da replicação viral do DNA), RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real), sequenciamento de RNA, manchas do Norte, espectrometria de massas, western blotting e análise da produção de DNA viral, que pode fornecer uma imagem mais global das atividades celulares.

Nós desenvolvemos estratégias do RNA Fish para examinar os produtos do RNA dos genes específicos e uma análise computacional que calcule quantitativamente a relação Mimivírus de um produto específico do gene. A preparação da amostra, modificada a partir de publicações anteriores por Steitz e colegas^{3,4, é}relativamente fácil e pode ser usada tanto para as células aderentes como as suspensas. O protocolo também é adaptável para o uso simultâneo de múltiplas estratégias de RNA Fish (duplo RNA FISH) ou RNA FISH com estratégias IF. O desenvolvimento de uma estratégia específica de FISH é desafiador, mas as sugestões para melhorar o sucesso são delineadas. A análise de dados descrita aqui é quantitativa se os grânulos fluorescentes e os marcadores fortes de limites do compartimento são usados e oferecem a introspecção adicional nas micrografias, introspecção que remove o viés da observação. O protocolo detalhado é projetado para as pilhas latentes e Lytic contaminadas por Kaposi ‘ o Herpesvirus sarcoma-associado de s (KSHV) e pode ser usado com as pilhas ou as pilhas não contaminadas por outros Herpesvirus⁵. Os métodos de quantificação são aplicáveis a estudos sobre turnos nucleocitímicos ou relocalização entre compartimentos subcelulares na maioria das células.