שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים
Summary
בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.
Abstract
בשלב החניכה של תרגום חלבונים, הריבוחלק נקשר לאזור החניכה של mRNA. אתחול תרגום ניתן לחסום על ידי איגוד של חלבון כריכת RNA (RBP) לאזור החניכה של mRNA, אשר מפריעה עם ריבוכמה הכריכה. בשיטה המוצגת, אנו מנצלים את תופעת החסימה הזאת לכמת את הזיקה המחייב של rbps לאתרים שאינם מחייבים קנצוני שלהם. כדי לעשות זאת, אנו מכניסים אתר מחייב בדיקה באזור החניכה של העיתונאי mRNA ולגרום לביטוי RBP הבדיקה. במקרה של RBP-RNA כריכה, הבחנו דיכוי החתימה של ביטוי הכתב כפונקציה של ריכוז RBP. במקרה של חוסר אהדה או זיקה נמוכה מאוד בין אתר האיגוד ל-RBP, לא נצפתה דיכוי משמעותי. השיטה מבוצעת בתאי חיידקי חיים, ואינה דורשת מכונות יקרות או מתוחכמות. היא שימושית לכימות והשוואה בין הקשרים המחייבים של האיגוד של RBPs שונים הפונקציונליים בחיידקים לקבוצה של אתרי איגוד מעוצבים. שיטה זו עשויה להיות לא מתאימה לאתרי איגוד בעלי מורכבות מבנית גבוהה. זאת בשל האפשרות של דיכוי של חניכה הריבוזומלית על ידי מבנה mRNA מורכב בהעדר RBP, אשר יגרום הביטוי הנמוך ביותר גנים כתבת בסיס, ולכן הדיכוי כתב פחות הנצפה על הכריכה RBP.
Introduction
ה-RNA כריכת חלבון (RBP) מבוסס לאחר ההמרה רגולציה, אפיון במיוחד של האינטראקציה בין Rbp ו-RNA, נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים. ישנן מספר דוגמאות של התקנה למטה הטרנסלtional בחיידקים שמקורם rbps עיכוב, או מתחרה ישירות עם, ריבוכמה קשירה1,2,3. בתחום הביולוגיה הסינתטית, האינטראקציות של rbp-RNA מתפתחות ככלי משמעותי לעיצוב המעגלים הגנטיים המבוססים על תמלול4,5. לכן, קיימת עלייה בביקוש לאפיון של אינטראקציות RBP-RNA כגון בהקשר הסלולר.
השיטות הנפוצות ביותר ללימוד אינטראקציות של חלבון-RNA הן שיטת השינוי בשיטת הניידות האלקטרופיניטית (emsa)6, המוגבלת להגדרות חוץ-גופית, ושונות משיכה מספר7, כולל שיטת הקליפ8,9 . בעוד שיטות כאלה לאפשר גילוי של אתרי האיגוד של דה נובו RNA, הם סובלים מחסרונות כגון פרוטוקולים עתירי עבודה ותגובות ברצף יקר והוא עשוי לדרוש נוגדן ספציפי עבור RBP למשוך למטה. בשל האופי הפגיע של RNA לסביבתו, גורמים רבים יכולים להשפיע על אינטראקציות RBP-RNA, תוך שימת דגש על החשיבות של חקירת מחייב RBP-RNA בהקשר הסלולר. לדוגמא, אנחנו ואחרים הדגמנו הבדלים משמעותיים בין מבני RNA בvivo ובתוך מבחנה10,11.
בהתבסס על הגישה של המחקר הקודם12, לאחרונה הפגינו10 כי כאשר ממקמים מעוצב מראש אתרי קשירה עבור capsid rbps מתוך בקטביאז GA13, MS214, PP715, ו Qβ16 ב התרגום האזור של כתבת mRNA, ביטוי העיתונאי הוא מודחק מאוד. אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית וכמותית, המבוססת על תופעה זו של דיכוי, כדי למדוד את הזיקה בין RBPs לאתר המקבילשל ה -RNA שלהם ב-vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה מקלה כמותית במדידה vivo של RBP-RNA הזיקה הקשירה בתאים E. coli . הפרוטוקול קל יחסית וניתן להתנהל ללא שימוש במכונות מתוחכמות, וניתוח נתונים הוא פשוט. כמו-כן, התוצאות מיוצרות מיד, ללא הזמן ההמתנה הארוך המשויך לתוצאות רצף הדור הבא (NGS).
מגבלה אחת לשיטה זו היא שזה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית ה-I-CORE של ועדת התכנון והתקצוב והקרן הישראלית למדעים (גרנט No. 152/11), מארי קירי שילוב מחדש של המענק לא. PCIG11-GA-2012-321675, ומאופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק מס ‘ 664918-MRG-דקדוק.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
- . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
- . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
- . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
- . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
- . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
- . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
