JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59611
, , , ,
1Department of Biotechnology and Food Engineering,Technion-Israel Institute of Technology, 2Russell Berrie Nanotechnology Institute,Technion-Israel Institute of Technology

Summary

В этом методе мы количественно связываем связывающее сродство связывающих белков РНК (RBPs) к cognate и неcognate связывающих сайтов с помощью простой, живой, репортер анализ в бактериальных клетках. Ассем основан на подавлении гена репортера.

Abstract

В шаге начала перевода протеина, ribosome связывает к зоне начала mRNA. Инициация перевода может быть заблокирована путем привязки связывающего белка РНК (RBP) к области инициации мРНК, которая мешает рибосомной связывания. В представленном методе мы используем это блокирующее явление для количественной оценки связывающей близости РБП к их cognate и не-cognate связывающих сайтов. Для этого мы вставляем тестовый узел связывания в область инициации репортера mRNA и индуцируем выражение теста RBP. В случае связывания RBP-РНК мы наблюдали сигмоидальные репрессии в отношении выражения репортера как функции концентрации РБП. В случае несродности или очень низкого сродства между связывающим сайтом и РБП не наблюдалось никаких существенных репрессий. Метод проводится в живых бактериальных клетках и не требует дорогостоящего или сложного оборудования. Это полезно для количественной оценки и сравнения связывающих сходств различных RBPs, которые функционируют в бактериях, чтобы набор разработанных мест связывания. Этот метод может быть неподходящим для связывающих сайтов с высокой структурной сложностью. Это должно к возможности репрессии ribosomal инициации сложной структурой mRNA в отсутствии RBP, которое привело бы к в более низком базальном экспрессии гена репортера, и таким образом более менее-наблюдаемых репрессиях репортера на связывании RBP.

Introduction

В последние десятилетия широко изучалась регулировка после транскрипционного регулирования, основанного на РНК-связывающем белке (RBP), в частности, характеристика взаимодействия между РСП и РНК. Есть несколько примеров переводного вниз регулирования бактерий, происходящих из RBPs ингибирования, или непосредственно конкурировать с, рибосома связывания1,2,3. В области синтетической биологии, RBP-РНК взаимодействия становятся важным инструментом для разработки транскрипции на основе генетических схем4,5. Таким образом, растет спрос на характеристику таких взаимодействий RBP-RNA в клеточном контексте.

Наиболее распространенными методами для изучения белково-РНК взаимодействий являются электрофоретические передвижные переплет анализа (EMSA)6, который ограничивается в настройках пробирки, и различные выдвижные анализы7, в том числе метод CLIP8,9 . Хотя такие методы позволяют обнаружить de novo РНК связывания сайтов, они страдают от недостатков, таких как трудоемкие протоколы и дорогие глубокие реакции секвенирования и может потребовать конкретного антитела для вытягивания RBP. Из-за восприимчивого характера РНК к окружающей среде, многие факторы могут повлиять на взаимодействие RBP-РНК, подчеркивая важность допроса РБП-РНК связывания в клеточном контексте. Например, мы и другие продемонстрировали значительные различия между структурами РНК in vivo и in vitro10,11.

Основываясь на подходе предыдущего исследования12, мы недавно продемонстрировали10, что при размещении предварительно разработанных обязательных сайтов для капсида RBPs от бактериофагов GA13, MS214, PP7,иNo 16 в перевод инициации области репортера мРНК, репортер выражение сильно репрессированных. Мы представляем относительно простой и количественный метод, основанный на этом феномене репрессий, для измерения сродства между RBPs и их соответствующим ими связывающим сайтом РНКs in vivo.

Protocol

1. Подготовка системы Дизайн обязательно-участок плазмиды Дизайн связывающей кассеты сайта, как показано на рисунке 1. Каждый миниген содержит следующие части (5′ до 3′): Место ограничения Eagl, 40 оснований 5′ конца гена сопротивления канамицина (Кан), промо…

Representative Results

Представленный метод использует конкуренцию между RBP и ribosome для связывать к молекуле мРНК (рисунок1). Эта конкуренция находит свое отражение в снижении уровня mCherry как функции увеличения производства RBP-mCerulean, в связи с увеличением концентрации индуктор…

Discussion

Метод, описанный в этой статье, облегчает количественное измерение связывания СВЯЗывающей РБП-РНК в клетках кишечной палочки. Протокол относительно прост и может быть проведен без использования сложного оборудования, а анализ данных прост. Кроме того, результаты получаются сразу…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект получил финансирование от Программы I-CORE Комитета по планированию и бюджетированию и Израильского научного фонда (Грант No 152/11), Гранта Марии Кюри по вопросам реинтеграции No. PCIG11-GA- 2012-321675, а также из программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 по грантовому соглашению No 664918 – MRG-Grammar.

Materials

Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8- lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
glycerol BIO LAB 071205
incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
ligase NEB B0202S
liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
  2. Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
  3. Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
  4. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  5. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
  6. Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
  7. Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
  8. Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  9. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  10. Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
  11. Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
  12. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  13. Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
  14. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  15. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  16. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
  17. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  18. . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
  19. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
  20. . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
  21. . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
  22. . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
  23. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  24. . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
  25. . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
  26. . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
  27. Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
  28. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
  29. Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
  30. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
  31. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  32. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
  33. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
  34. Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
  35. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
  36. Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).

Tags

Protein-RNA BindingRNA Binding ProteinRBP-RNA AffinityIn VivoPlasmid DesignBinding Site CassetteMCherry Reporter GeneRBP SequenceBacterial TransformationGlycerol Stocks

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image