Summary

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Published: July 10, 2019
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Summary

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Abstract

La espectroscopia de fuerza de célulaúnica basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SCFS) es una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biofísicas de las células vivas. Esta técnica permite sondear las fuerzas de interacción y la dinámica en una membrana celular viva, incluyendo aquellos entre las células, receptor y ligandos, y junto con muchas otras variaciones. También funciona como un mecanismo para entregar un estímulo físico o bioquímico en células individuales de una manera controlada espaciotemporalmente, permitiendo así la activación celular específica y los eventos celulares subsiguientes para ser monitoreadoen en tiempo real cuando se combina con células vivas fluorescencia. El paso clave en esas mediciones AFM-SCFS es la funcionalización AFM-cantilever, o en otras palabras, adjuntar un sujeto de interés al voladizo. Aquí, presentamos métodos para modificar los voladizos AFM con una sola célula T y un solo cordón de poliestireno respectivamente para estudios inmunológicos. El primero implica un pegamento biocompatible que acopla células T individuales a la punta de un voladizo plano en una solución, mientras que el segundo se basa en un pegamento epoxi para la adhesión de un solo cordón en el ambiente del aire. También se proporcionan dos aplicaciones inmunológicas asociadas con cada modificación en voladizo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente a diferentes tipos de células y partículas sólidas.

Introduction

La microscopía de fuerza atómica (AFM), una herramienta versátil, ha encontrado muchas aplicaciones en la investigación de biología celular1,2,3,4,5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución, la función nativa de sondeo de fuerza permite investigar directamente las propiedades biofísicas de las células vivas in situ en el nivel6deuna sola célula,7. Estas incluyen las rigideces de las estructuras subcelulares o incluso células enteras8,9,10,11,12, ligando /receptor específico nivel de molécula única en la superficie celular13, y fuerzas de adhesión entre pares únicos de partículas sólidas y células o entre dos células1,2,14,15. Estos dos últimos se clasifican a menudo como espectroscopía de fuerza de una sola célula (SCFS)16. Debido a los voladizos fácilmente disponibles con varias constantes de resorte, el rango de fuerza accesible para AFM es bastante amplio desde unos piconewtons (pN) hasta micronewtons (N), que cubre adecuadamente toda la gama de eventos celulares que involucran fuerzas de unas pocas decenas de pN, como la unión de una sola molécula basada en receptores, a nN, como los eventos celulares fagocíticos15. Este gran rango de fuerza dinámica hace que el AFM sea ventajoso sobre otras técnicas de sondeo de fuerza, como pinzas ópticas/magnéticas y una sonda de fuerza de biomembrana, ya que son más adecuados para mediciones de fuerza débil, con una fuerza típicamente inferior a 200 pN17 , 18. Además, AFM puede funcionar como un manipulador de alta precisión para entregar varios estímulos en células individuales de una manera espaciotemporalmente definida4,19. Esto es deseable para los estudios de activación de una sola célula en tiempo real. En combinación con las imágenes de fluorescencia de células vivas, la respuesta celular posterior al estímulo específico se puede monitorear simultáneamente, haciendo que el SCFS basado en AFM sea extremadamente robusto como imágenes ópticas que proporcionan una herramienta práctica para sondear la señalización celular. Por ejemplo, AFM se utilizó para determinar las cepas necesarias para obtener transitorios de calcio en osteoblastos20. En este trabajo, los transitorios de calcio fueron rastreados fluorescentemente a través de imágenes métricas de relación de calcio después de la aplicación de fuerzas localizadas en osteoblastos cultivados con una punta de AFM. Recientemente, se empleó AFM para estirar fibrillas de colágeno en las que se cultivaban células estelares hepáticas (HSC) y esta activación de HSC transducida por mecano fue monitoreada en tiempo real por un biosensor fluorescente Src, cuya fosforilación representada por el la intensidad de la fluorescencia del biosensor está correlacionada con la activación de HSC3.

En los experimentos SCFS basados en AFM, la funcionalización adecuada de los voladizos AFM es un paso clave hacia mediciones exitosas. Dado que nuestro interés en la investigación se centra en la activación de las células inmunitarias, funcionalizamos rutinariamente losvoladizos con partículas, como partículas sólidas individuales que pueden desencadenar fagocitosis y/o respuestas inmunitarias fuertes 4,14 , 15 y células T únicas que pueden formar una sinapsis inmune con células que presentan antígeno, como células dendríticas activadas (DC)2. Las partículas sólidas individuales normalmente se acoplan a un voladizo a través de un pegamento epoxi en el entorno del aire, mientras que las células T individuales, debido a su naturaleza no adhesiva, se funcionalizan a un voladizo a través de un pegamento biocompatible en solución. Aquí, describimos los métodos para realizar estos dos tipos de modificación en voladizo y dar dos aplicaciones asociadas también. La primera aplicación es sondear las interacciones de células T/DC con AFM-SCFS para comprender el mecanismo supresor de las células T reguladoras desde el punto de vista de la mecánica celular. El segundo consiste en combinar AFM con imágenes de fluorescencia de células vivas para monitorear la respuesta celular de macrófagos a una partícula sólida en tiempo real para revelar el mecanismo molecular de fosfatidilinositol independiente del receptor 4,5-bisfosfato (PIP2)- La moesina mediaba en la fagocitosis. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco de referencia para que los investigadores interesados diseñen e implementen sus propios entornos experimentales con análisis de una sola célula basados en AFM para la investigación inmunológica.

Protocol

El protocolo de experimento de ratón sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Tsinghua 1. Funcionalización en voladizo con células T únicas Preparación de células de bazo de ratón Sacrificar el ratón (8-16 semanas de edad (ya sea sexo); por ejemplo, cepa C57BL/6) usando dióxido de carbono, seguido de luxación cervical. Limpie el ratón con 75% de etanol y haga una incisión cutánea de línea media seguida de una esplenectomía. …

Representative Results

La Figura 4A muestra las curvas típicas de fuerza-distancia de la interacción de enlace entre la célula de una T y la sola CC en un ciclo de aproximación-retracción. La curva roja clara es la curva de extensión y la roja oscura es la curva de retracción. Dado que la curva de extensión se utiliza normalmente para la sangría o el análisis de rigidez, aquí sólo la curva de retracción se refiere a la adhesión de celdas. El valor mínimo (el círculo…

Discussion

La espectroscopia de fuerza de una sola célula basada en AFM ha evolucionado hasta convertirse en una poderosa herramienta para abordar las propiedades biofísicas de las células vivas. Para esas aplicaciones, el voladizo debe ser funcionalizado correctamente con el fin de sondear interacciones específicas o propiedades en las celdas de interés. Aquí, se describen los métodos para acoplar una sola célula T y un solo micronés a la voladizo sin punta, respectivamente. Para fijar una sola célula T al voladizo, se e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31370878), el Programa Clave del Estado (31630023) y el Programa de Grupos de Investigación Innovadora (81621002).

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

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Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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