Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

La microscopie de force atomique (AFM), un outil polyvalent, a trouvé de nombreuses applications dans la recherche en biologie cellulaire^1,2,3,4,5. Outre sa capacité d’imagerie à haute résolution, la fonction de recherche de force native permet d’étudier directement in situ les propriétés biophysiques des cellules vivantes au niveau unicellulaire^6,7. Il s’agit notamment des rigidités des structures subcellulaires ou même des cellules entières^8,9,10,11,12, des forces spécifiques de liaison ligand/récepteur à la niveau d’une seule molécule sur la surface cellulaire¹³, et les forces d’adhérence entre les paires simples de particules solides et les cellules ou entre deux cellules^1,2,14,15. Ces deux derniers sont souvent classés comme spectroscopie de force unicellulaire (SCFS)¹⁶. En raison des cantilevers facilement disponibles avec diverses constantes de ressort, la gamme de force accessible à l’AFM est assez large de quelques piconewtons (pN) aux micronewtons (N), qui couvre adéquatement toute la gamme des événements cellulaires impliquant des forces de quelques dizaines de pN, comme la liaison à base de récepteurs à une seule molécule, à nN, tels que les événements cellulaires phagocytiques¹⁵. Cette grande plage de force dynamique rend l’AFM avantageux par-dessus d’autres techniques de recherche de force telles que les pinces optiques/magnétiques et une sonde de force de biomembrane, car elles sont plus appropriées pour des mesures de force faible, avec la force typiquement inférieure à 200 pN^{17 , 18}. En outre, l’AFM peut fonctionner comme un manipulateur de haute précision pour délivrer divers stimuli sur des cellules simples d’une manière spatiotemporellement définie^4,19. Ceci est souhaitable pour les études d’activation unicellulaire en temps réel. Combinée à l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes, la réponse cellulaire subséquente au stimulus spécifique peut être surveillée simultanément, ce qui rend le SCFS à base d’AFM extrêmement robuste comme imagerie optique fournissant un outil pratique pour sonder la signalisation cellulaire. Par exemple, l’AFM a été utilisée pour déterminer les souches nécessaires pour obtenir des transitoires de calcium dans les ostéoblastes²⁰. Dans ce travail, les transitoires de calcium ont été suivis fluorescentpar par l’imagerie ratiométrique de calcium après l’application des forces localisées sur les ostéoblastes cultivés avec une pointe d’AFM. Récemment, l’AFM a été employée à étirer des fibrilles de collagène sur lesquelles les cellules stellates hépatiques (HSC) ont été cultivées et cette activation mécano-transduced de HSC a été en temps réel surveillée par un biocapteur fluorescent src, dont la phosphorylation telle que représentée par le l’intensité de fluorescence du biocapteur estcorrélée avec l’activation de HSC 3.

Dans les expériences SCFS basées sur l’AFM, la bonne fonctionnalisation des cantilevers AFM est une étape clé vers des mesures réussies. Puisque notre intérêt de recherche se concentre sur l’activation des cellules immunitaires, nous fonctionnions systématiquement les cantilevers avec des matières particulaires telles que les particules solides simples qui peuvent déclencher la phagocytose et/ou les réponses immunitaires fortes^{4,14 , 15} et les lymphocytes T simples qui peuvent former une synapse immunitaire avec des cellules présentant des antigènes, telles que les cellules dendritiques activées (DC)². Les particules solides simples sont normalement couplées à un porte-à-faux via une colle époxy dans l’environnement de l’air, tandis que les lymphocytes T simples, en raison de leur nature non-adhésive, sont fonctionnalisés à un porte-à-faux via une colle biocompatible en solution. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer ces deux types de modification de porte-à-faux et donnons deux applications associées aussi bien. La première application consiste à sonder les interactions lymphocytes T/DC avec L’AFM-SCFS pour comprendre le mécanisme suppressif des lymphocytes T régulateurs du point de vue de la mécanique cellulaire. La deuxième consiste à combiner l’AFM avec l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes pour surveiller la réponse cellulaire du macrophage à une particule solide en temps réel pour révéler le mécanisme moléculaire du phosphatidylinositol indépendant des récepteurs 4,5-bisphosphate (PIP2)- Moesin a médiatisé la phagocytose. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre de référence pour les chercheurs intéressés à concevoir et à mettre en œuvre leurs propres paramètres expérimentaux avec l’analyse à base d’AFM à une seule cellule pour la recherche immunologique.