Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

La microscopia a forza atomica (AFM), uno strumento versatile, ha trovato molte applicazioni nella ricerca sulla biologia cellulare^1,2,3,4,5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione, la funzione nativa di sonda di forza consente di studiare direttamente le proprietà biofisiche delle cellule viventi in situ al livello a cella singola^6,7. Questi includono le rigidità delle strutture subcellulari o anche le cellule intere^8,9,10,^11,12, specifici punti di forza di legamento / recettore livello di singola molecola sulla superficie cellulare¹³, e le forze di adesione tra singole coppie di particelle solide e cellule o tra due cellule^1,2,14,15. Questi ultimi due sono spesso classificati come spettroscopia a forza singola (SCFS)¹⁶. A causa dei cantilever prontamente disponibili con varie costanti primaverili, la gamma di forza accessibile all’AFM è piuttosto ampia da pochi piconewtons (pN) a micronewton (N), che copre adeguatamente l’intera gamma di eventi cellulari che coinvolgono forze di poche decine di pN, come il legame a singola molecola basato sul recettore, a nN, come gli eventi cellulari fagocitici¹⁵. Questa vasta gamma di forza dinamica rende l’AFM vantaggioso rispetto ad altre tecniche di sonda di forza come le pinzette ottiche/magnetiche e una sonda di forza biomembrana, in quanto sono più adatte per misurazioni a forza debole, con forza tipicamente inferiore a 200 pN^{17 , 18.}Inoltre, l’AFM può funzionare come manipolatore ad alta precisione per fornire vari stimoli su singole celle in modo spatiotemporale^4,19. Questo è auspicabile per gli studi di attivazione di una singola cellula in tempo reale. In combinazione con l’imaging a fluorescenza delle cellule vive, la successiva risposta cellulare allo stimolo specifico può essere monitorata contemporaneamente, rendendo così SCFS basato su AFM estremamente robusto come imaging ottico che fornisce uno strumento pratico per sondare la segnalazione cellulare. Per esempio, AFM è stato utilizzato per determinare i ceppi necessari per suscitare transitori di calcio negli osteoblasti²⁰. In questo lavoro, i transitori di calcio sono stati tracciati fluorescente attraverso l’imaging ratiometrico del calcio dopo l’applicazione di forze localizzate su osteoblasti coltivati con una punta AFM. Recentemente, AFM è stato impiegato per allungare fibrille di collagene su cui sono state coltivate cellule epatiche stellate (HSC) e questa attivazione di HSC trassedanti mechano è stata monitorata in tempo reale da un biosensore Src fluorescente, la cui fosforolazione come l’intensità di fluorescenza del biosensore è correlata all’attivazione HSC³.

Negli esperimenti SCFS basati su AFM, una corretta funzionalizzazione dei cantilever AFM è un passo fondamentale verso misurazioni di successo. Dal momento che il nostro interesse di ricerca si concentra sull’attivazione delle cellule immunitarie, abbiamo regolarmente funzionalizzante i sbalzioni con particolato come singole particelle solide che possono innescare la fagocitosi e/o forti risposte immunitarie^{4,14 , 15} e singole cellule T che possono formare una sinapsi immunitaria con antigene che presenta cellule, come le cellule dendritiche attivate (DC)². Le singole particelle solide sono normalmente accoppiate a un cantilever tramite una colla epossidica nell’ambiente atmosferico, mentre le singole cellule T, a causa della loro natura non adesiva, sono funzionalizzate a un sbalzo tramite una colla biocompatibile in soluzione. Qui, descriviamo i metodi per eseguire questi due tipi di modifica a sbalzo e diamo anche due applicazioni associate. La prima applicazione è quella di sondare le interazioni tra cellule T e DC con AFM-SCFS per comprendere il meccanismo soppressivo delle cellule T regolatorie dal punto di vista della meccanica cellulare. Il secondo consiste nel combinare AFM con l’imaging a fluorescenza a cellule vive per monitorare la risposta cellulare del macrofago a una particella solida in tempo reale per rivelare il meccanismo molecolare del fosfatoindipendentene 4,5-bisphofosfatolo 4,5-bisphosphatel (PIP2)- Moesin mediava la fagocitosi. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro di riferimento per i ricercatori interessati per progettare e implementare le proprie impostazioni sperimentali con l’analisi unicellulare basata su AFM per la ricerca immunologica.