Summary

Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Published: July 10, 2019
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Summary

Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.

Abstract

A microscopia de força atômica baseou a espectroscopia da força da única pilha (AFM-SCFS) é uma ferramenta poderosa para estudar Propriedades biofísicas de pilhas vivas. Esta técnica permite a sondagem de pontos fortes e dinâmicas de interação em uma membrana celular viva, incluindo aquelas entre células, receptores e ligantes, e ao lado de muitas outras variações. Igualmente trabalha como um mecanismo para entregar um estímulo físico ou bioquímico em únicas pilhas em uma maneira spatiotemporally controlada, assim permitindo a ativação específica da pilha e os eventos celulares subseqüentes a ser monitorados no tempo real quando combinados com a viver-pilha imagem latente da fluorescência. O passo chave nessas medições AFM-SCFS é a funcionalização do AFM-cantilever, ou seja, anexar um assunto de interesse ao cantilever. Aqui, nós apresentamos métodos para modificar cantialavancas de AFM com uma única pilha de T e um único grânulo do poliestireno respectivamente para estudos imunológicos. O primeiro envolve uma colagem biocompatível que acopla únicas pilhas de T à ponta de um cantilever liso em uma solução, quando o último depender em uma colagem da cola Epoxy para a única aderência do grânulo no ambiente do ar. Duas aplicações imunológicas associadas a cada modificação do cantilever são fornecidas também. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a diferentes tipos de células e partículas sólidas.

Introduction

A microscopia da força atômica (AFM), uma ferramenta versátil, encontrou muitas aplicações na pesquisa da biologia da pilha1,2,3,4,5. Aparte de sua capacidade de imagem latente de alta resolução, a característica da força-sondagem nativa permite que as propriedades biofísicas de pilhas vivas sejam investigadas diretamente in situ no nível da único-pilha6,7. Estes incluem a rigidez de estruturas subcelulares ou mesmo células inteiras8,9,10,11,12, ligante específico/receptor de forças de ligação no nível de molécula única na superfície celular13, e forças de aderência entre pares de partículas sólidas e células ou entre duas células1,2,14,15. Os dois últimos são frequentemente categorizados como espectroscopia de força de célula única (SCFS)16. Devido aos cantialavancos prontamente disponíveis com vária mola constante, a escala da força acessível a AFM é rather larga de alguns piconewtons (pN) aos micronewtons (μN), que cobre adequadamente a escala inteira de eventos celulares que envolvem forças de algumas dezenas de pN, como ligação de molécula única baseada em receptores, a nN, como eventos celulares fagocíticos15. Esta grande escala dinâmica da força faz AFM vantajoso sobre outras técnicas da forçar-sondagem tais como pinças óticos/magnéticos e uma ponta de prova da força do biomembrana, porque são mais apropriadas para medidas da fraco-força, com força tipicamente menos do que 200 PN17 , 18. Além disso, AFM pode funcionar como um manipulador de alta precisão para entregar vários estímulos em células individuais em uma forma espaciotemporalmente definida4,19. Isso é desejável para os estudos de ativação de célula única em tempo real. Combinada com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha, a resposta celular subseqüente ao estímulo específico pode ser monitorada simultaneamente, assim fazendo o SCFS AFM-baseado excessivamente robusto como a imagem latente ótica que fornece uma ferramenta prática para sondar a sinalização celular. Por exemplo, AFM foi utilizado para determinar as cepas necessárias para provocar transientes de cálcio em osteoblastos20. Neste trabalho, os transientes do cálcio foram controlados cDNAs com a imagem latente ratiométrica do cálcio após a aplicação de forças localizadas em osteoblastos cultivados com uma ponta de AFM. Recentemente, AFM foi empregado para esticar as fibrilas do colagénio em que as pilhas stellate hepatic (HSC) estiveram crescidas e esta ativação mechano-transaculada de HSC era tempo real monitorado por um biosensor fluorescente do src, cuja o fosforilação como representado pelo a intensidade da fluorescência do biosensor é correlacionada com a ativação de HSC3.

Em experimentos SCFS baseados em AFM, a funcionalização adequada de cantimanhas AFM é um passo fundamental para medições bem-sucedidas. Desde que nosso interesse da pesquisa centra-se sobre a ativação das pilhas imunes, nós funcionamos rotineiramente cantialavancas com matérias particuladas tais como únicas partículas contínuas que podem provocar o fagocitose e/ou respostas imunes fortes4,14 , 15 e células T únicas que podem formar uma sinapse imune com células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas ativadas (DC)2. As únicas partículas contínuas são acopladas normalmente a um cantilever através de uma colagem da cola Epoxy no ambiente do ar, visto que as únicas pilhas de T, devido a sua natureza não-adesiva, são funcionalizadas a um cantilever através de uma colagem biocompatível na solução. Aqui, descrevemos os métodos para executar esses dois tipos de modificação cantilever e dar duas aplicações associadas também. A primeira aplicação é sondar interações de T Cell/DC com AFM-SCFS para compreender o mecanismo supressor de células T reguladoras do ponto de vista da mecânica celular. O segundo envolve a combinação de AFM com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha para monitorar a resposta celular do macrófago a uma partícula contínua no tempo real para revelar o mecanismo molecular do fosfatidilinositol receptor-independente 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediou a fagocitose. O objetivo deste protocolo é fornecer um quadro de referência para que pesquisadores interessados projetem e implementem seus próprios parâmetros experimentais com análise de células simples baseadas em AFM para pesquisa imunológica.

Protocol

O protocolo da experimentação do rato segue as directrizes do cuidado animal da Universidade de Tsinghua 1. funcionalização do cantilever com únicas pilhas de T Preparação das pilhas do spleen do rato Sacrifique o rato (8-16 semanas de idade (ou sexo); por exemplo, C57BL/6 estirpe) utilizando dióxido de carbono, seguido de luxação cervical. Limpe o rato com 75% de etanol e faça uma incisão cutânea de linha média seguida de esplenectomia. Ho…

Representative Results

A figura 4a mostra curvas de força-distância típicas da interação de ligação entre a célula single-T e o single-DC em um ciclo de retração de abordagem. A curva vermelha clara é a curva da extensão e o vermelho escuro um é a curva da retração. Desde que a curva da extensão é usada tipicamente para o recuo ou a rigidez-análise, aqui somente a curva da retração é concernida para a adesão da pilha. O valor mínimo (o círculo verde) na curv…

Discussion

A espectroscopia da força da único-pilha baseada em AFM evoluiu para ser uma ferramenta poderosa para endereçar as propriedades biofísicas de pilhas vivas. Para essas aplicações, o cantilever precisa ser funcionalizada corretamente, a fim de sondar interações específicas ou propriedades sobre as células de interesse. Aqui, os métodos para acoplando a única pilha de T e a única grânulo Micron-feitos medida ao modilhão Tip-less são descritos respectivamente. Para prender uma única pilha de T ao cantilever,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais do programa geral da China (31370878), programa de chave estatal (31630023) e programa de grupo de pesquisa inovadora (81621002).

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

References

  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
  3. Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
  4. Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
  5. Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
  6. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  7. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
  8. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
  9. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  10. Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
  11. Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
  12. Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
  13. Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
  14. Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
  15. Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
  16. Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
  17. Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
  18. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  19. Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
  20. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  21. Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
  22. Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
  23. Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
  24. Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
  25. Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
  26. Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
  27. Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
  28. Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
  29. Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  30. Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).

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Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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