Summary

Funksjonalisering av Atomic Force mikroskop utkragning med single-T celler eller single-partikkel for immunologiske single-Cell Force spektroskopi

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

Vi presenterer en protokoll for å funksjonalisere atomkraftmikroskop (AFM) utkragning med en enkelt T celle og perle partikkel for immunologiske studier. Prosedyrer for å granske single-pair T celle-dendrittiske celle binding av AFM og å overvåke sanntids mobilnettet respons av makrofager til en enkelt solid partikkel av AFM med fluorescens Imaging vises.

Abstract

Atomic Force mikroskopi basert enkelt celle kraft spektroskopi (AFM-SCFS) er et kraftig verktøy for å studere Biofysiske egenskaper levende celler. Denne teknikken gjør det mulig for undersøkelser interaksjon styrker og dynamikk på en levende celle membran, inkludert de mellom celler, reseptor og ligander, og sammen med mange andre varianter. Det fungerer også som en mekanisme for å levere en fysisk eller biokjemiske stimulans på enkeltceller i en spatiotemporally kontrollert måte, og dermed tillater spesifikk celle aktivering og påfølgende cellulære hendelser som skal overvåkes i sanntid når kombinert med live-celle fluorescens avbildning. Nøkkelen trinn i disse AFM-SCFS målingene er AFM-cantilever funksjonalisering, eller med andre ord, knytter et emne av interesse for cantilever. Her presenterer vi metoder for å endre AFM utkragning med en enkelt T-celle og en enkelt polystyren perle henholdsvis for immunologiske studier. Den førstnevnte innebærer en biokompatible lim som par enkelt T-celler til spissen av en flat cantilever i en løsning, mens sistnevnte er avhengig av en epoxy lim for enkelt perle vedheft i luft miljøet. To immunologiske søknader knyttet til hver cantilever modifikasjon er gitt også. Metodene som beskrives her, kan enkelt tilpasses forskjellige celletyper og faste partikler.

Introduction

Atomic Force mikroskopi (AFM), et allsidig verktøy, har funnet mange programmer i Cell Biology Research1,2,3,4,5. Bortsett fra den høye oppløsning Imaging evne, den innfødte Force-undersøkelser funksjonen lar Biofysiske egenskaper levende celler som skal undersøkes direkte in situ på single-cellenivå6,7. Disse inkluderer Stivheter av subcellulære strukturer eller hele celler8,9,10,11,12, spesifikke ligand/reseptor bindende styrke ved enkelt molekylnivå på cellen Surface13, og vedheft styrker mellom enkelt par av faste partikler og celler eller mellom to celler1,2,14,15. De to sistnevnte er ofte kategorisert som single-Cell Force spektroskopi (SCFS)16. På grunn av den lett tilgjengelige utkragning med ulike våren konstant, kraften området tilgjengelig for AFM er ganske bred fra noen få piconewtons (pN) til micronewtons (μN), som tilstrekkelig dekker hele spekteret av cellulære hendelser som involverer styrker fra noen titalls av pN, slik som reseptor-baserte single-molekylet bindende, til nN, for eksempel phagocytic mobilnettet hendelser15. Denne store dynamisk kraft utvalg gjør AFM fordelaktig over andre makt-undersøkelser teknikker som optisk/magnetisk pinsett og en biomembrane kraft sonde, som de er mer egnet for svake-kraft målinger, med makt vanligvis mindre enn 200 pN17 , 18. i tillegg kan AFM fungere som en høy presisjon manipulator å levere ulike stimuli på enkeltceller i en spatiotemporally definert måte4,19. Dette er ønskelig for Real-Time single-celle aktivering studier. Kombinert med live-celle fluorescens Imaging, den påfølgende cellulære responsen til den spesifikke stimulans kan overvåkes samtidig, og dermed gjør AFM-baserte SCFS overmåte robust som optisk Imaging gir et praktisk verktøy for å granske mobilnettet signalering. For eksempel ble AFM brukt til å bestemme stammene som kreves for å lokke fram kalsium transienter i osteoblaster20. I dette arbeidet ble kalsium transienter spores fluorescensmerkete gjennom kalsium ratiometrisk Imaging etter påføring av lokaliserte styrker på kultivert osteoblaster med en AFM spissen. Nylig ble AFM ansatt for å strekke kollagen fibrils som hepatic Stel celler (HSC) ble dyrket og denne mechano-transduced HSC aktivisering var sanntid overvåkes av en fluorescerende src Biosensor, hvis fosforylering som representeres av fluorescens intensiteten av Biosensor er korrelert med HSC aktivisering3.

I AFM-baserte SCFS eksperimenter, riktig funksjonalisering av AFM utkragning er et viktig skritt mot vellykkede målinger. Siden vår forskning interesse fokuserer på immunceller aktivisering, vi rutinemessig funksjonalisere utkragning med partikler saker som enkelt faste partikler som kan utløse fagocytose og/eller sterke immunresponser4,14 , 15 og enkelt T celler som kan danne en immun synapse med antigen presentere celler, for eksempel aktiverte dendrittiske celler (DC)2. Enkelt faste partikler er normalt koblet til en cantilever via en epoxy lim i luft miljøet, mens enkelt T-celler, på grunn av deres ikke-selvklebende natur, er funksjonalisert til en cantilever via en biokompatible lim i løsningen. Her beskriver vi metodene for å utføre disse to typer cantilever modifikasjon og gi to tilhørende applikasjoner også. Det første programmet er å granske T Cell/DC interaksjoner med AFM-SCFS å forstå den undertrykkende mekanismen av regulatoriske T-celler fra cellen mekanikk synspunkt. Den andre innebærer å kombinere AFM med live-celle fluorescens Imaging å overvåke cellulære responsen av macrophage til en solid partikkel i sanntid for å avdekke den molekylære mekanismen av reseptor-uavhengige phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediert fagocytose. Målet med denne protokollen er å gi en referanse rammeverk for interesserte forskere til å designe og implementere sine egne eksperimentelle innstillinger med AFM-basert enkelt celle analyse for immunologiske forskning.

Protocol

Musen eksperiment protokollen følger dyre omsorgen retningslinjer for Tsinghua University 1. cantilever funksjonalisering med enkelt T-celler Mus milt celler forberedelse Ofre musen (8-16 uker av alder (enten sex); f. eks, C57BL/6 belastning) ved hjelp av karbondioksid, etterfulgt av cervical forvridning. Rengjør musen med 75% etanol og lage en midtlinjen huden snitt etterfulgt av splenektomi. Homogenisere milten i 4 mL PBS inneholder 2% fosterets stor…

Representative Results

Figur 4a viser vanlige kraft avstands kurver fra bindings samhandlingen mellom enkelt-T-celle og Single-DC i én metode-trekk-syklus. Den lyse røde kurven er forlengelses kurven, og den mørke røde er en tilbaketrekking kurve. Siden forlengelsen kurve brukes vanligvis for innrykk eller stivhet-analyse, her bare tilbaketrekking kurve er bekymret for celle vedheft. Minimumsverdien (den grønne sirkelen) i kurven gir et mål på maksimal vedheft kraft. Område…

Discussion

AFM-baserte enkelt celle kraft spektroskopi har utviklet seg til å være et kraftig verktøy for å ta opp de Biofysiske egenskapene til levende celler. For disse programmene, må cantilever være funksjonalisert riktig for å granske bestemte interaksjoner eller egenskaper på celler av interesse. Her er metodene for kobling enkelt T-celle og enkelt mikron størrelse perle til spissen-mindre cantilever er beskrevet henholdsvis. For å feste en enkelt T-celle til cantilever, ble en biokompatible lim valgt som celle lim….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina General program (31370878), State Key program (31630023) og innovative Research Group program (81621002).

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

References

  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
  3. Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
  4. Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
  5. Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
  6. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  7. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
  8. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
  9. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  10. Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
  11. Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
  12. Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
  13. Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
  14. Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
  15. Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
  16. Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
  17. Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
  18. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  19. Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
  20. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  21. Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
  22. Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
  23. Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
  24. Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
  25. Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
  26. Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
  27. Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
  28. Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
  29. Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  30. Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).

Play Video

Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

View Video