Summary

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。

Abstract

原子力顕微鏡ベースの単一細胞力分光法(AFM-SCFS)は、生細胞の生物物理学的特性を研究するための強力なツールです。この技術は、細胞、受容体およびリガンド間の相互作用の強さとダイナミクスを、他の多くのバリエーションと共に調知することを可能にする。また、単一細胞に対して物理的または生化学的刺激を時空間的に制御した方法で送り出すメカニズムとしても機能し、生細胞と組み合わせると、特定の細胞活性化とその後の細胞イベントをリアルタイムで監視することができます。蛍光イメージング。これらのAFM-SCFS測定の重要なステップは、AFM片持ち機能化、つまり、目的の対象を片持ちに取り付けることです。ここでは、免疫学的研究のために、単一のT細胞と単一のポリスチレンビーズでAFM片持ちを修飾する方法を紹介する。前者は、溶液中の平らな片持ちの先端に単一のT細胞を結合する生体適合性の接着剤を含み、後者は空気環境における単一ビーズ接着のためのエポキシ接着剤に依存する。各片持ち修正に関連する2つの免疫学的応用も同様に提供される。ここで説明する方法は、異なる細胞タイプおよび固体粒子に容易に適合させることができる。

Introduction

原子力顕微鏡(AFM)、汎用性の高いツールは、細胞生物学研究1、2、3、4、5で多くの応用を発見しました。その高解像度イメージング機能とは別に、ネイティブ力プローブ機能により、生細胞の生物物理学的特性を単一細胞レベル6、7の現場で直接調べることができる。これらには、細胞内構造または細胞全体の剛性8、9、10、11、12、特異的リガンド/受容体結合強度が含まれる。細胞表面上の単一分子レベル13は、固体粒子と細胞の単一対間または2つの細胞間の接着力1、2、14、15。後者の2つは、多くの場合、単一細胞力分光法(SCFS)16として分類される。様々なばね定数を持つ容易に利用可能な片持ちのために、AFMにアクセス可能な力範囲は、数十からの力を含む細胞イベントの全範囲を十分にカバーするいくつかのピコニュートン(pN)からマイクロニュートン(μN)までかなり広いです。受容体ベースの単一分子結合などのpNの、nNへの、例えば、咽頭細胞イベント15。この大きなダイナミックフォースレンジは、光学/磁気ピンセットやバイオ膜力プローブなどの他の力プローブ技術に比べてAFMに有利であり、弱力測定に適しており、通常は200 pN17未満の力を持ちます。,18.さらに、AFMは、時空間的に定義された方法単一細胞に様々な刺激を提供する高精度マニピュレータとして機能することができます 4,19.これは、リアルタイム単一細胞活性化研究に望ましい。生細胞蛍光イメージングと組み合わせることで、特定の刺激に対するその後の細胞応答を同時に監視できるため、AFMベースのSCFSは光学イメージングとして非常に堅牢になり、細胞シグナル伝達をプローブする実用的なツールを提供します。例えば、AFMは、骨芽細胞20でカルシウム過渡を引き出すために必要な株を決定するために使用された。本研究では、AFM先端を用いた培養骨芽細胞への局所的な力の適用後、カルシウム過渡性画像を用いてカルシウム過渡を蛍光で追跡した。最近では、肝系ステラー細胞(HSC)が増殖したコラーゲン線維化を伸縮するためにAFMが採用され、このメカノ変換HSC活性化は蛍光Srcバイオセンサによってリアルタイムモニタリングされ、そのリン酸化物は、バイオセンサの蛍光強度は、HSC活性化3と相関している。

AFMベースのSCFS実験では、AFM片持ち式の適切な機能化が測定の成功に向けた重要なステップです。私たちの研究の関心は免疫細胞の活性化に焦点を当てているので、我々は定期的に食細胞症や強力な免疫応答を引き起こす可能性のある単一固体粒子などの粒子状物質を持つ片持ちを機能化 4,14,活性化樹状細胞(DC)2などの抗原提示細胞を有する免疫シナプスを形成できる15および単一T細胞。 単一固体粒子は、通常、空気中のエポキシ接着剤を介して片持ちに結合されますが、単一のT細胞は、その非粘着性の性質のために、溶液中の生体適合性接着剤を介して片持ちに機能化されます。ここでは、これら2種類の片持ち修正を行い、2つの関連するアプリケーションを提供する方法について説明する。最初の応用は、AFM-SCFSとのT細胞/DC相互作用をプローブし、細胞力学の観点から制御T細胞の抑制機構を理解することです。2つ目は、AFMと生細胞蛍光イメージングを組み合わせて、受容体非依存ホスファチリノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)の分子機構を明らかにするために、固体粒子に対するマクロファージの細胞応答をリアルタイムで監視することを含む。モエシンは、咽頭細胞症を媒介した。このプロトコルの目的は、興味を持つ研究者が免疫学的研究のためのAFMベースの単一細胞分析を用いて独自の実験設定を設計し、実装するための参照フレームワークを提供することです。

Protocol

マウス実験プロトコルは清華大学の動物ケアガイドラインに従う 1. 単一T細胞による片持ち可能な機能化 マウス脾臓細胞製剤 二酸化炭素を用いてマウス(8〜16週齢(どちらかの性別)を犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行う。 75%のエタノールでマウスをきれいにし、中間線の皮膚切開を行い、脾臓摘出を行います。 ガラススライドを使用して2%…

Representative Results

図4Aは、1つのアプローチリトラクトサイクルにおける単一Tセルと単一DCとの結合相互作用からの典型的な力距離曲線を示す。明るい赤い曲線は延長曲線で、濃い赤のカーブは引き込み曲線です。延長曲線は通常、インデントまたは剛性解析に使用されるので、ここでは引き込み曲線のみが細胞接着に関係します。曲線の最小値(緑色の円)は、最?…

Discussion

AFMベースの単細胞力分光法は、生細胞の生体物理学的特性に対処するための強力なツールとして進化してきました。これらのアプリケーションでは、目的の細胞上の特定の相互作用または特性をプローブするために、片持ちは適切に機能化する必要があります。ここで、単一T細胞と単一ミクロンサイズのビーズを先端のない片持ち先に結合する方法についてそれぞれ説明する。片持ち式に単…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(31370878)、国家キープログラム(31630023)、革新的研究グループプログラム(81621002)によって支援されています。

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

References

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Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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