Summary

Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

Published: July 10, 2019
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Summary

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser le microscope de force atomique (AFM) cantilevers avec une seule cellule T et particule de perle pour des études immunologiques. Des procédures pour sonder la liaison de cellule T-dendritic à paire simple par AFM et pour surveiller la réponse cellulaire en temps réel des macrophages à une seule particule solide par AFM avec la formation image de fluorescence sont montrées.

Abstract

La spectroscopie à force atomique à base de force monocellulaire (AFM-SCFS) est un outil puissant pour étudier les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Cette technique permet de sonder les forces d’interaction et la dynamique sur une membrane cellulaire vivante, y compris celles entre les cellules, les récepteurs et les ligands, et aux côtés de nombreuses autres variations. Il fonctionne également comme un mécanisme pour fournir un stimulus physique ou biochimique sur les cellules simples d’une manière spatiotemporellement contrôlée, permettant ainsi l’activation cellulaire spécifique et les événements cellulaires suivants à surveiller en temps réel lorsqu’il est combiné avec la cellule vivante l’imagerie par fluorescence. L’étape clé de ces mesures AFM-SCFS est la fonctionnalisation en porte-à-faux AFM, ou en d’autres termes, l’attachement d’un sujet d’intérêt au porte-à-faux. Ici, nous présentons des méthodes pour modifier des cantilevers d’AFM avec une seule cellule T et une perle de polystyrène simple respectivement pour des études immunologiques. Le premier implique une colle biocompatible qui associe les lymphocytes T simples à la pointe d’un porte-à-faux plat dans une solution, tandis que le second s’appuie sur une colle époxy pour l’adhérence à perles simples dans l’environnement de l’air. Deux applications immunologiques associées à chaque modification de porte-à-faux sont également fournies. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées à différents types de cellules et de particules solides.

Introduction

La microscopie de force atomique (AFM), un outil polyvalent, a trouvé de nombreuses applications dans la recherche en biologie cellulaire1,2,3,4,5. Outre sa capacité d’imagerie à haute résolution, la fonction de recherche de force native permet d’étudier directement in situ les propriétés biophysiques des cellules vivantes au niveau unicellulaire6,7. Il s’agit notamment des rigidités des structures subcellulaires ou même des cellules entières8,9,10,11,12, des forces spécifiques de liaison ligand/récepteur à la niveau d’une seule molécule sur la surface cellulaire13, et les forces d’adhérence entre les paires simples de particules solides et les cellules ou entre deux cellules1,2,14,15. Ces deux derniers sont souvent classés comme spectroscopie de force unicellulaire (SCFS)16. En raison des cantilevers facilement disponibles avec diverses constantes de ressort, la gamme de force accessible à l’AFM est assez large de quelques piconewtons (pN) aux micronewtons (N), qui couvre adéquatement toute la gamme des événements cellulaires impliquant des forces de quelques dizaines de pN, comme la liaison à base de récepteurs à une seule molécule, à nN, tels que les événements cellulaires phagocytiques15. Cette grande plage de force dynamique rend l’AFM avantageux par-dessus d’autres techniques de recherche de force telles que les pinces optiques/magnétiques et une sonde de force de biomembrane, car elles sont plus appropriées pour des mesures de force faible, avec la force typiquement inférieure à 200 pN17 , 18. En outre, l’AFM peut fonctionner comme un manipulateur de haute précision pour délivrer divers stimuli sur des cellules simples d’une manière spatiotemporellement définie4,19. Ceci est souhaitable pour les études d’activation unicellulaire en temps réel. Combinée à l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes, la réponse cellulaire subséquente au stimulus spécifique peut être surveillée simultanément, ce qui rend le SCFS à base d’AFM extrêmement robuste comme imagerie optique fournissant un outil pratique pour sonder la signalisation cellulaire. Par exemple, l’AFM a été utilisée pour déterminer les souches nécessaires pour obtenir des transitoires de calcium dans les ostéoblastes20. Dans ce travail, les transitoires de calcium ont été suivis fluorescentpar par l’imagerie ratiométrique de calcium après l’application des forces localisées sur les ostéoblastes cultivés avec une pointe d’AFM. Récemment, l’AFM a été employée à étirer des fibrilles de collagène sur lesquelles les cellules stellates hépatiques (HSC) ont été cultivées et cette activation mécano-transduced de HSC a été en temps réel surveillée par un biocapteur fluorescent src, dont la phosphorylation telle que représentée par le l’intensité de fluorescence du biocapteur estcorrélée avec l’activation de HSC 3.

Dans les expériences SCFS basées sur l’AFM, la bonne fonctionnalisation des cantilevers AFM est une étape clé vers des mesures réussies. Puisque notre intérêt de recherche se concentre sur l’activation des cellules immunitaires, nous fonctionnions systématiquement les cantilevers avec des matières particulaires telles que les particules solides simples qui peuvent déclencher la phagocytose et/ou les réponses immunitaires fortes4,14 , 15 et les lymphocytes T simples qui peuvent former une synapse immunitaire avec des cellules présentant des antigènes, telles que les cellules dendritiques activées (DC)2. Les particules solides simples sont normalement couplées à un porte-à-faux via une colle époxy dans l’environnement de l’air, tandis que les lymphocytes T simples, en raison de leur nature non-adhésive, sont fonctionnalisés à un porte-à-faux via une colle biocompatible en solution. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer ces deux types de modification de porte-à-faux et donnons deux applications associées aussi bien. La première application consiste à sonder les interactions lymphocytes T/DC avec L’AFM-SCFS pour comprendre le mécanisme suppressif des lymphocytes T régulateurs du point de vue de la mécanique cellulaire. La deuxième consiste à combiner l’AFM avec l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes pour surveiller la réponse cellulaire du macrophage à une particule solide en temps réel pour révéler le mécanisme moléculaire du phosphatidylinositol indépendant des récepteurs 4,5-bisphosphate (PIP2)- Moesin a médiatisé la phagocytose. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre de référence pour les chercheurs intéressés à concevoir et à mettre en œuvre leurs propres paramètres expérimentaux avec l’analyse à base d’AFM à une seule cellule pour la recherche immunologique.

Protocol

Le protocole d’expérience de la souris suit les directives de soins aux animaux de l’Université de Tsinghua 1. Fonctionnalisation en porte-à-faux avec des lymphocytes T simples Préparation des cellules de la rate de souris Sacrifiez la souris (8-16 semaines d’âge (soit sexe); par exemple, c57BL/6 souche) en utilisant le dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale. Nettoyez la souris avec 75% d’éthanol et faites une incision cutanée médiane suivie d’…

Representative Results

La figure 4A montre les courbes de force-distance typiques de l’interaction de liaison entre la cellule simple-T et le seul DC dans un cycle d’approche-rétractation. La courbe rouge clair est la courbe d’extension et la courbe rouge foncé est la courbe de rétraction. Puisque la courbe d’extension est généralement utilisée pour l’indentation ou l’analyse de rigidité, ici seulement la courbe de rétraction est concernée pour l’adhérence cellulaire. La …

Discussion

La spectroscopie à force unicellulaire à base d’AFM a évolué pour devenir un outil puissant pour aborder les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Pour ces applications, le porte-à-faux doit être fonctionnalisé correctement afin de sonder des interactions ou des propriétés spécifiques sur les cellules d’intérêt. Ici, les méthodes pour coucoupler la cellule T simple et la perle de micron simple-classée au porte-à-faux tip-less sont décrites respectivement. Pour attacher une seule cellule T au po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux sont appuyés par le National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), le State Key Program (31630023) et le Innovative Research Group Program (81621002).

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

References

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Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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