Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie
Summary
We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.
Abstract
Atoom kracht microscopie gebaseerde eencellige kracht spectroscopie (AFM-SCFS) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van biofysische eigenschappen van levende cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de sterktes en dynamiek van interacties op een levend celmembraan te indringende, inclusief die tussen cellen, receptor en liganden, en naast vele andere variaties. Het werkt ook als een mechanisme voor het leveren van een fysieke of biochemische stimulans op afzonderlijke cellen in een spatiotemporaal gecontroleerde manier, waardoor specifieke celactivering en daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen in real-time worden bewaakt in combinatie met Live-cel fluorescentie beeldvorming. De belangrijkste stap in die AFM-SCFS-metingen is AFM-Cantilever functionalisatie, of met andere woorden, het koppelen van een onderwerp van belang aan de Cantilever. Hier presenteren we methoden voor het wijzigen van de AFM-cantihefbomen met een enkele T-cel en een enkele polystyreen kraal voor immunologische studies. De eerste omvat een biocompatibele lijm die koppels enkele T cellen aan de punt van een vlakke vrijdragende in een oplossing, terwijl de laatste is gebaseerd op een epoxy lijm voor enkele kraal hechting in de lucht omgeving. Twee immunologische toepassingen in verband met elke aanpassing van de cantilever worden ook verstrekt. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende celtypen en vaste deeltjes.
Introduction
Atomic Force microscopie (AFM), een veelzijdig instrument, heeft veel toepassingen gevonden in onderzoek naar celbiologie1,2,3,4,5. Afgezien van de beeldvormings capaciteit met hoge resolutie, kunnen met de native Force-probing-functie biofysische eigenschappen van levende cellen direct in situ worden onderzocht op het eencellige niveau6,7. Deze omvatten de rigiditeiten van subcellulaire structuren of zelfs hele cellen8,9,10,11,12, specifieke ligand/receptor bindende sterktes op de enkel molecuul niveau op het celoppervlak13, en adhesie krachten tussen enkelvoudige paren van vaste deeltjes en cellen of tussen twee cellen1,2,14,15. De laatste twee zijn vaak gecategoriseerd als single-cell Force spectroscopie (SCFS)16. Vanwege de gemakkelijk verkrijgbare cantihefbomen met verschillende veerconstante, is het kracht bereik dat toegankelijk is voor de AFM vrij breed van een paar piconewtons (pN) tot micronewtons (μN), die adequaat betrekking hebben op het hele bereik van cellulaire gebeurtenissen waarbij krachten van enkele tientallen van pN, zoals receptor-gebaseerde enkelvoudige molecuul binding, aan nN, zoals fagocytische cellulaire gebeurtenissen15. Dit grote dynamische kracht bereik maakt de AFM voordelig ten opzichte van andere kracht-probing technieken zoals optische/magnetische pincet en een biomembraan kracht sonde, omdat ze meer geschikt zijn voor zwakke-krachtmetingen, met kracht meestal minder dan 200 pN17 , 18. Daarnaast kan de AFM functioneren als een uiterst nauwkeurige manipulator om verschillende stimuli op afzonderlijke cellen te leveren in een spatiotemporeel gedefinieerde manier4,19. Dit is wenselijk voor de real-time activering van eencellige onderzoeken. In combinatie met Live-cel fluorescentie beeldvorming kan de daaropvolgende cellulaire respons op de specifieke stimulus gelijktijdig worden gemonitord, waardoor de op de AFM gebaseerde SCF’S uitermate robuust zijn als optische beeldvorming die een praktisch hulpmiddel biedt om cellulaire signalering te controleren. Zo werd de AFM gebruikt om de stammen te bepalen die nodig waren om calcium transiënten in osteoblasten20uit te lokken. In dit werk werden calcium transiënten fluorescently gevolgd door calcium ratiometrische beeldvorming na de toepassing van gelokaliseerde krachten op gekweekte osteoblasten met een AFM-tip. Onlangs werd de AFM gebruikt om collageen fibrillen op te rekken waarop hepatische ecoagriturismo late cellen (HSC) werden geteeld en deze mechano-transduced HSC activering werd Real-time gemonitord door een fluorescerende src biosensor, waarvan de fosforylering zoals vertegenwoordigd door de de fluorescentie intensiteit van de biosensor is gecorreleerd met HSC Activation3.
In de op AFM gebaseerde SCFS-experimenten is een goede functionalisatie van AFM-cantihefbomen een belangrijke stap in de richting van succesvolle metingen. Omdat onze onderzoeksinteresse zich richt op immuuncellen activatie, functionaliseren we routinematig cantihefbomen met deeltjes zoals enkelvoudige vaste deeltjes die fagocytose en/of sterke immuunresponsen kunnen triggeren4,14 , 15 en enkele T-cellen die een immuunsynaps kunnen vormen met antigeen die cellen presenteren, zoals geactiveerde dendritische cellen (DC)2. Enkelvoudige vaste deeltjes worden normaliter gekoppeld aan een Cantilever via een epoxy lijm in de lucht omgeving, terwijl enkelvoudige T-cellen, vanwege hun niet-klevende aard, worden gefunctionaliseerd tot een Cantilever via een biocompatibele lijm in oplossing. Hier beschrijven we de methoden om deze twee typen Cantilever modificatie uit te voeren en geven we ook twee gekoppelde toepassingen. De eerste toepassing is het sonde T cel/DC interacties met AFM-SCFS om te begrijpen van de suppressieve mechanisme van regelgevende T cellen van het oogpunt van de cel mechanica. De tweede omvat het combineren van de AFM met een live-cel fluorescentie beeldvorming om de cellulaire respons van macrofaag op een vast deeltje in real-time te monitoren om het moleculaire mechanisme van receptor-onafhankelijke phosphatidylinositol-4, 5-bisfosfaat(PIP2)- Moesin gemedieerde phagocytose. Het doel van dit protocol is om een referentiekader te bieden voor geïnteresseerde onderzoekers om hun eigen experimentele instellingen te ontwerpen en te implementeren met een op de AFM gebaseerde eencellige analyse voor immunologisch onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
De op de AFM gebaseerde eencellige kracht spectroscopie is geëvolueerd tot een krachtig hulpmiddel om de biofysische eigenschappen van levende cellen aan te pakken. Voor deze toepassingen moet de cantilever correct worden gefunctionaliseerd om specifieke interacties of eigenschappen op de cellen van belang te sonde. Hier worden de methoden voor het koppelen van enkele T-cellen en één-micron-formaat kraal naar de punt-minder-Cantilever respectievelijk beschreven. Om een enkele T-cel aan de cantilever te bevestigen, wer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) en Innovative Research Group Program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
