Summary

VirWaTest, un método de punto de uso para la detección de virus en muestras de agua

Published: May 11, 2019
doi:

Summary

Aquí presentamos VirWaTest, que es un método simple, asequible y portátil para la concentración y detección de virus de muestras de agua en el punto de uso.

Abstract

Los virus excretados por humanos y animales pueden contaminar las fuentes de agua y representar un riesgo para la salud humana cuando esta agua se utiliza para beber, irrigación de alimentos, lavado, etc. El indicador clásico de bacterias fecales no siempre comprueba la presencia de patógenos virales, por lo que la detección de patógenos vímicos e indicadores virales es relevante para adoptar medidas de mitigación del riesgo, especialmente en escenarios humanitarios y en zonas cuando los brotes virales transmitidos por el agua son frecuentes.

En la actualidad, varias pruebas comerciales que permiten la cuantificación de bacterias indicadoras fecales (FIB) están disponibles para su análisis en el punto de uso. Sin embargo, tales pruebas comerciales no están disponibles para la detección de virus. La detección de virus en muestras de agua ambiental requiere concentrar varios litros en volúmenes más pequeños. Además, una vez concentrado, la detección de virus se basa en métodos como la extracción de ácido nucleico y la detección molecular (por ejemplo, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) de los genomas virales.

El método descrito aquí permite la concentración de virus a partir de muestras de agua de 10 L, así como la extracción de ácidos nucleicos virales en el punto de uso, con equipos simples y portátiles. Esto permite la prueba de muestras de agua en el punto de uso de varios virus y es útil en escenarios humanitarios, así como en cualquier contexto donde no se dispone de un laboratorio equipado. Alternativamente, el método permite concentrar los virus presentes en las muestras de agua y el envío del concentrado a un laboratorio a temperatura ambiente para su posterior análisis.

Introduction

Durante las primeras fases de cualquier emergencia humanitaria, el acceso a suministros de agua potable, saneamiento e higiene es fundamental para la supervivencia de los afectados. Por lo tanto, el control de la calidad del agua es una prioridad para prevenir brotes transmitidos por el agua. Es bien sabido que el agua contaminada es con frecuencia el origen de las enfermedades, pero a menudo es difícil determinar las fuentes de brotes virales como el virus de la hepatitis E (HEV), incluso con la disponibilidad de métodos de laboratorio convencionales. El control de la calidad del agua se basa en la cuantificación de FIB1,2,3,4. Sin embargo, se ha documentado ampliamente que no existe correlación entre la ausencia de FIB y la presencia de patógenosvirales transmitidos por el agua como rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV 5,6. Por lo tanto, el uso de los criterios de calidad del agua basados en la FIB podría dar lugar a una subestimación de los riesgos asociados con la presencia de patógenos virales transmitidos por el agua. La vigilancia de los virus indicadores, como los adenovirus humanos (HAdV), o patógenos específicos sería útil para definir la exposición a patógenos víricas e identificar la fuente potencial de infección humana7,8, 9,10 y en la validación de la eficacia de las medidas de saneamiento11.

Hasta ahora, la detección de virus en estos escenarios dependía de personal cualificado y logística compleja. VirWaTest (virwatest.org) está dirigido al desarrollo de un método simple, asequible y portátil para la concentración y posterior detección de virus a partir de muestras de agua en el punto de uso.

La concentración del virus se basa en el principio de floculación orgánica de muestras de agua de 10 L, mediante la cual los virus se recuperan en volúmenes más pequeños12,13. Los flocs se recogen y se añaden a un tampón que lyses los virus y evita que los ácidos nucleicos de degradación cuando se almacenaron a temperatura ambiente durante no más de 2 semanas.

El método de extracción de ácido nucleico se basa en el uso de partículas magnéticas a las que los ácidos nucleicos se absorben. Se pueden transferir de un tampón de lavado a otro y finalmente al tampón de elución mediante el uso de una pipeta magnética a la que se adhieren las partículas. Las suspensiones de ácido nucleico viral obtenidas se pueden enviar a un laboratorio de referencia donde la detección se puede realizar utilizando métodos moleculares basados en PCR. Para cada extracción de ácido nucleico, se prueban dos cantidades diferentes para descartar la inhibición enzimática originada por la muestra. Alternativamente, con una disponibilidad mínima del equipo, las pruebas de PCR se pueden ejecutar en el punto de uso. Todo el proceso está diseñado para realizarse independientemente de una fuente de alimentación (Figura1).

Un ensayo cuantitativo de PCR para detectar el Vhv, excretado por los seres humanos y encontrado en muestras de aguas residuales en altas concentraciones, se ha adaptado para ser ejecutado en el punto de uso. HAdV se utilizan como indicadores virales fecales humanos. También se ha adaptado un PCR para la cuantificación del bacteriófago MS2 desde que MS2 se utiliza en VirWaTest como control de procesos. El método se puede personalizar para la detección de cualquier virus de interés.

Después del desarrollo, el método VirWaTest ha sido aplicado por los usuarios en dos configuraciones diferentes en la República de Frica Central (RCA) y Ecuador, proporcionando retroalimentación sobre la aplicación del protocolo en situaciones reales.

Hasta nuestro punto de conocimiento, este es el primer procedimiento que permite la concentración y detección de virus en el punto de uso, independientemente de cualquier fuente de alimentación, equipos de gran tamaño y condiciones de congelación/refrigeración. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua con el fin de obtener resultados robustos.

Protocol

1. Preparación y envasado NOTA: Los materiales/equipos que se van a embalar se enumeran en la Tabla1. Utilice guantes para manipular los reactivos necesarios para el control del proceso, los reactivos de concentración, los reactivos de extracción de ácido nucleico y los reactivos de detección. Use gafas protectoras para manipular los reactivos necesarios para la extracción de ácido nucleico. Control de procesos Preparar el cultivo de…

Representative Results

Desarrollo de métodos Este procedimiento ha sido desarrollado en el Laboratorio de Virus Contaminantes del Agua y Alimentos con la colaboración de GenIUL y Oxfam Intermón. Consta de tres pasos diferentes. La primera, la concentración de partículas virales, es una adaptación de un método de floculación de leche desnatada descrito anteriormente12,17</sup…

Discussion

El método VirWaTest permite la concentración de virus y la extracción de ácido nucleico de muestras de agua en el punto de uso por usuarios no experimentados. Es un protocolo asequible, rápido y simple. La concentración se basa en el principio de la floculación orgánica utilizando leche desnatada, por el cual el bajo pH y las condiciones de alta conductividad hacen que las proteínas de leche desnatadas se acumulen en flocs los virus adsorbe. Cuando el sedimento flocs, es fácil de recoger, lo que permite concent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VirWaTest fue un proyecto de investigación financiado por el programa HIF (Humanitarian Innovation Funds) de ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Los autores reconocen a los equipos de WASH que amablemente colaboraron en este estudio. El análisis de muestras en Ecuador fue financiado por Oxfam Ecuador y Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Américas (AMB). BRT.17.01). S. Bofill-Mas es serra-hunter becarios en la Universidad de Barcelona.

Materials

5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) Solis BioDyne 08-14-00001 Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions
8-Microtube Strips with Caps dD Biolab 840637 Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR
Aquagenx CBT E. coli Kit Aquagenx, LLC ECCBT10 10 Tests per Kit
Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer GenIUL 900011674 Includes 12V car power adapter
Bucket Support GenIUL 900011648 Aluminium support
Bucket, 10 L Cater4You 10LTR Polypropilene, Tamperproof, Clear color
Centrifuge Tube, 50 mL LabBox CTSP-E50-050 Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt
Citric Acid 1-Hydrate, 500 g PanReac AppliChem 1410181211 Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram
Clear PET Bottle LabBox FPET-500-088 Clear Color, PET, Cap Not Included
Difco Skim Milk, 500 g Becton Dickinson 232100 Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL Zymo Research R1100-250 DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL
Easy9 Pipette Controller LabBox EAS9-001-001 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder
Eppendorf Tube, 0.5 mL Eppendorf 0030121023 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL Eppendorf 0030120094 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL dD Biolab 999542 Polypropylene, Sterile, Graduated
Ethanol 96% V/V, 1 L Panreac AppliChem 361085-1611 For UV, IR  and HPLC
Laboratory Tweezers LabBox FORS-007-002 Thin, Curved End, L= 120 mm
Magnetic Stirrer GenIUL 900017000 Battery-powered
Marker dD Biolab 929203 Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware
Micro Rota-Rack for Microtubes dD Biolab 37782 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler Coyote Biosciences, China Mini-8 Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes
NucliSens Lysis Buffer Biomerieux 200292 Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature
Open Tip Serological Pipette, 10 mL Deltalab 900136N Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
PE Screw Cap PP28 LabBox TP28-004-020 For PET Bottles
pH Indicator Strip LabBox WSPH-001-001 Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack
Plastic Test Tube Quimikals 300913 Includes Cap
Polyethylene Pasteur Pipette LabBox PIPP-003-500 Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL Deltalab 409726 Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL Deltalab 409526G Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL
Powder Powder Detergent Regular Powder Soap for washing clothes
Power Cables for Magnetic Stirrer GenIUL 900011692 Connection between batteries and magnetic stirrers
QuickPick Magnetic Tool BioNobile 24001 Hand-held tool for magnetic particles
QuickPick Tips in Box BioNobile 24296 RNase-Free, Autoclaved, 96 Units
QuickPick XL gDNA Magnetic Particles BioNobile SN51100 3.2 mL
Sea Salts Sigma-Aldrich S9883-500G An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water
Silicone Tubing LabBox SILT-006-005 Roll of 5 Meters, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% VWR Chemicals 28244295 Pellets, 1 Kg
Solar Rotary Platform SOL-EXPERT Group 70020 Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams
SOLIScript 1-step Probe Kit Solis BioDyne 08-57-00250 Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit BioTools 21.141-4197 Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet dD Biolab 045926 Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm, Blue
Tape-End Serological Pipette, 10 mL Deltalab PN10E1 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mL Deltalab 900043 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover BioTools 22001-4291 Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL
Water Molecular Biology Reagent, 1L Sigma-Aldrich W4502-1L Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered
Whirl-Pak Bag, 540 mL Deltalab 200361 Stable bottom
Zip Lock Plain Bag LabBox BZIP-080-100 Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm

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Aguado, D., Fores, E., Guerrero-Latorre, L., Rusiñol, M., Martínez-Puchol, S., Codony, F., Girones, R., Bofill-Mas, S. VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. J. Vis. Exp. (147), e59463, doi:10.3791/59463 (2019).

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