Summary

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

Published: May 11, 2019
doi:

Summary

여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.

Abstract

인간과 동물에 의해 배설된 바이러스는 수원을 오염시키고 이 물이 음주, 식품 관개, 세척 등에 사용될 때 인간의 건강에 위험을 초래할 수 있습니다. 고전적인 대변 박테리아 표시기는 항상 바이러스 성 병원체의 존재를 검사하지 않으므로 바이러스 성 병원체 및 바이러스 지표의 검출은 특히 인도주의적 시나리오및 지역에서 위험 완화 조치를 채택하기 위해 관련이 있습니다. 수인성 바이러스 발병이 빈번한 경우.

현재, 대변 지표 박테리아 (FIB)의 정량화를 허용하는 몇몇 상업적인 시험은 사용의 시점에서 시험을 위해 유효합니다. 그러나, 이러한 상업적 인 테스트는 바이러스의 검출을 위해 사용할 수 없습니다. 환경 용수 샘플에서 바이러스를 검출하려면 몇 리터를 더 작은 부피로 농축해야 합니다. 더욱이, 일단 집중되면, 바이러스의 검출은 바이러스 게놈의 핵산 추출 및 분자 검출(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응[PCR]-기반 분석법)과 같은 방법에 의존한다.

여기에 설명된 방법은 10 L 물 샘플에서 바이러스의 농도뿐만 아니라 사용 시점에서 바이러스 성 핵산의 추출을 간단하고 휴대용 장비로 허용합니다. 이를 통해 여러 바이러스에 대한 사용 시점에서 물 샘플을 테스트할 수 있으며, 인도주의 적 시나리오뿐만 아니라 장착 된 실험실을 사용할 수없는 모든 상황에서 유용합니다. 양자택일로, 방법은 추가 분석을 위해 상온에서 실험실에 물 견본및 농축물의 선적에 존재하는 바이러스를 집중시키는 것을 허용합니다.

Introduction

인도주의적 비상 사태의 첫 단계 동안 깨끗한 물 공급, 위생 및 위생에 대한 접근은 영향을받는 사람들의 생존에 매우 중요합니다. 따라서 수질 모니터링은 수인성 발생을 방지하는 것이 최우선 과제입니다. 오염된 물은 질병의 기원이 빈번하게 알려져 있지만, 기존의 실험실 방법의 가용성에도 불구하고 E형 간염 바이러스 (HEV)와 같은 바이러스 발병의 원인을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 수질의 제어는FIB1,2,3,4의정량화를 기반으로합니다. 그러나, FIB의 부재와 로타바이러스(RoV), 노로바이러스(NoV) 또는 HEV5,6과같은 바이러스 성 수인성 병원균의 존재 사이에 상관관계가 없다는 것이 광범위하게 문서화되어 있다. 따라서, FIB에 근거한 수질 기준을 사용하면 수인성 바이러스 성 병원균의 존재와 관련된 위험의 과소 평가가 발생할 수 있습니다. 인간 아데노바이러스(HAdV) 또는 특정 병원체와 같은 지표 바이러스의 감시는 바이러스 성 병원체에 대한 노출을 정의하고인간 감염의 잠재적 원인을 식별하는 데 도움이 될 것입니다 7,8, 9,도 10 및 위생 대책 의 효능을 검증하는데 11.

지금까지 이러한 시나리오에서 바이러스를 탐지하는 것은 숙련된 직원과 복잡한 물류에 의존했습니다. VirWaTest (virwatest.org)는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 후속 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법의 개발을 목표로한다.

바이러스 농도는 10 L 물 샘플의 유기 응고 원리에 기초하며, 바이러스가12,13더 작은 양으로 회수됩니다. flocs는 수집되고 바이러스를 용해하고 2 주 이상 실온에서 저장될 때 핵산이 분해되는 것을 방지하는 완충제에 추가됩니다.

핵산 추출 방법은 핵산이 흡착되는 자기 입자의 사용을 기반으로합니다. 그들은 입자가 부착하는 자기 파이펫을 사용하여 한 세척 버퍼에서 다른 세척 버퍼로 마지막으로 용출 버퍼로 전송될 수 있습니다. 얻어진 바이러스 성 핵산 현탁액은 PCR에 근거를 둔 분자 방법을 사용하여 검출이 수행될 수 있는 기준 실험실로 발송될 수 있습니다. 각 핵산 추출에 대해, 2개의 다른 양은 견본에 기인한 효소 억제를 배제하기 위하여 시험됩니다. 또는 최소한의 장비 가용성으로 PCR 테스트를 사용 지점에서 실행할 수 있습니다. 전체 프로세스는 전원 공급 장치와 독립적으로 수행되도록 설계되었습니다(그림 1).

인간에 의해 배설되고 고농도의 폐수 샘플에서 발견되는 HAdV를 검출하는 정량적 PCR 분석은 사용 시점에서 실행되도록 조정되었습니다. HAdV는 인간의 배설물 바이러스 지표로 사용됩니다. MS2 박테리오파지의 정량화를 위한 PCR은 MS2가 VirWaTest에서 공정 제어로 사용되기 때문에 적응되었습니다. 이 방법은 관심 있는 바이러스의 검출을 위해 사용자 정의할 수 있다.

개발 후 VirWaTest 메서드는 중앙 아프리카 공화국 (RCA) 및 에콰도르에서 두 가지 다른 설정에서 사용자에 의해 적용 되었습니다., 실제 상황에서 프로토콜의 응용 프로그램에 대 한 피드백을 제공 하 고.

우리의 지식에, 이것은 어떤 전원 공급 장치, 대형 장비 및 동결 / 냉각 조건과 관계없이 사용 시점에서 바이러스의 농도 및 검출을 허용하는 첫 번째 절차입니다. 강력한 결과를 얻으려면 각 물 샘플의 두 개의 복제를 수집하는 것이 좋습니다.

Protocol

1. 준비 및 포장 참고: 포장할 재료/장비는 표1에 나와 있습니다. 장갑을 사용하여 공정 제어, 농도 시약, 핵산 추출 시약 및 검출 시약에 필요한 시약을 처리합니다. 핵산 추출에 필요한 시약을 처리하기 위해 보호 안경을 착용하십시오. 공정 제어 ISO 절차 10705-1:199514에따라 실험실에서 1 x 1010 PFU/mL을 포함하는 M…

Representative Results

방법 개발 이 절차는 GenIUL과 옥스팜 인터몬의 협력으로 물과 식품의 바이러스 오염 물질 실험실에서 개발되었습니다. 그것은 세 가지 단계로 구성되어 있습니다. 제 1, 바이러스 입자 농도는, 앞서 설명한12,17,18에기재된 탈지 우유 응집 방법의 …

Discussion

VirWaTest 방법은 경험이 없는 사용자가 사용하는 시점에서 물 샘플에서 바이러스 및 핵산 추출의 농도를 가능하게 합니다. 저렴하고 빠르며 간단한 프로토콜입니다. 농도는 낮은 pH및 높은 전도성 조건이 탈지 우유 단백질이 바이러스 흡착을 흡착하는 flocs로 집합하게하는 탈지 우유를 사용하여 유기 응고의 원리에 기초한다. flocs 퇴적물은 수집하기 쉬우므로 10L의 물을 농축할 수 있는 반면, 전통적…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VirWaTest는 ELHRA의 HIF (인도주의 혁신 기금) 프로그램에 의해 투자 된 연구 프로젝트 (인도주의 적 지원을위한 학습 및 연구 강화). 저자는 이 연구에서 친절하게 협력한 WASH 팀을 인정합니다. 에콰도르의 샘플 분석은 옥스팜 에콰도르와 디레시온 드 인베티가시오네스 드 라 유니버시다드 데 라스 아메리카스(AMB)의 지원을 받았습니다. BRT.17.01). S. 보필 마스는 바르셀로나 대학의 세라 헌터 펠로우입니다.

Materials

5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) Solis BioDyne 08-14-00001 Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions
8-Microtube Strips with Caps dD Biolab 840637 Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR
Aquagenx CBT E. coli Kit Aquagenx, LLC ECCBT10 10 Tests per Kit
Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer GenIUL 900011674 Includes 12V car power adapter
Bucket Support GenIUL 900011648 Aluminium support
Bucket, 10 L Cater4You 10LTR Polypropilene, Tamperproof, Clear color
Centrifuge Tube, 50 mL LabBox CTSP-E50-050 Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt
Citric Acid 1-Hydrate, 500 g PanReac AppliChem 1410181211 Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram
Clear PET Bottle LabBox FPET-500-088 Clear Color, PET, Cap Not Included
Difco Skim Milk, 500 g Becton Dickinson 232100 Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL Zymo Research R1100-250 DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL
Easy9 Pipette Controller LabBox EAS9-001-001 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder
Eppendorf Tube, 0.5 mL Eppendorf 0030121023 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL Eppendorf 0030120094 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL dD Biolab 999542 Polypropylene, Sterile, Graduated
Ethanol 96% V/V, 1 L Panreac AppliChem 361085-1611 For UV, IR  and HPLC
Laboratory Tweezers LabBox FORS-007-002 Thin, Curved End, L= 120 mm
Magnetic Stirrer GenIUL 900017000 Battery-powered
Marker dD Biolab 929203 Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware
Micro Rota-Rack for Microtubes dD Biolab 37782 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler Coyote Biosciences, China Mini-8 Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes
NucliSens Lysis Buffer Biomerieux 200292 Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature
Open Tip Serological Pipette, 10 mL Deltalab 900136N Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
PE Screw Cap PP28 LabBox TP28-004-020 For PET Bottles
pH Indicator Strip LabBox WSPH-001-001 Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack
Plastic Test Tube Quimikals 300913 Includes Cap
Polyethylene Pasteur Pipette LabBox PIPP-003-500 Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL Deltalab 409726 Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL Deltalab 409526G Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL
Powder Powder Detergent Regular Powder Soap for washing clothes
Power Cables for Magnetic Stirrer GenIUL 900011692 Connection between batteries and magnetic stirrers
QuickPick Magnetic Tool BioNobile 24001 Hand-held tool for magnetic particles
QuickPick Tips in Box BioNobile 24296 RNase-Free, Autoclaved, 96 Units
QuickPick XL gDNA Magnetic Particles BioNobile SN51100 3.2 mL
Sea Salts Sigma-Aldrich S9883-500G An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water
Silicone Tubing LabBox SILT-006-005 Roll of 5 Meters, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% VWR Chemicals 28244295 Pellets, 1 Kg
Solar Rotary Platform SOL-EXPERT Group 70020 Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams
SOLIScript 1-step Probe Kit Solis BioDyne 08-57-00250 Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit BioTools 21.141-4197 Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet dD Biolab 045926 Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm, Blue
Tape-End Serological Pipette, 10 mL Deltalab PN10E1 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mL Deltalab 900043 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover BioTools 22001-4291 Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL
Water Molecular Biology Reagent, 1L Sigma-Aldrich W4502-1L Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered
Whirl-Pak Bag, 540 mL Deltalab 200361 Stable bottom
Zip Lock Plain Bag LabBox BZIP-080-100 Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm

References

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Aguado, D., Fores, E., Guerrero-Latorre, L., Rusiñol, M., Martínez-Puchol, S., Codony, F., Girones, R., Bofill-Mas, S. VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. J. Vis. Exp. (147), e59463, doi:10.3791/59463 (2019).

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