Summary

עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

Published: August 22, 2019
doi:

Summary

הדמיה ספקטרלית הפך פתרון אמין לזיהוי והפרדה של אותות מרובים של זריחה במדגם אחד והוא יכול בקלות להבחין אותות של עניין מרקע או פלואורסצנטית אוטומטי. עירור-סריקת הדמיה hyperקטרראלית משפרת בטכניקה זו על ידי הפחתת הזמן הדרוש לרכישת תמונה תוך הגברת היחס האות לרעש.

Abstract

טכניקות אחדות מסתמכות על גילוי אותות של קרינה פלואורסצנטית כדי לזהות או לחקור תופעות או להבהיר פונקציות. הפרדת האותות הללו בעלי קרינה פלואורסצנטית הוכחו מסורבל עד הופעתו של הדמיה היפרספקטראלית, שבו מקורות פלואורסצנטית ניתן להפריד זה מזה, כמו גם מאותות הרקע ומלא התאמה אוטומטית (נתון הידע של שלהם ספקטרלי חתימות). עם זאת, מסורתי, סריקת פליטה הדמיה hyperקטרלית סובלת מזמני רכישה איטית ויחס אות לרעש נמוך בשל הסינון הדרוש של שני עירור ואור פליטה. זה כבר הוכח כי עירור הדמיה היפרספקטקטרלית מפחית את זמן הרכישה הדרוש תוך הגברת היחס אות לרעש של נתונים שנרכשו. באמצעות ציוד מסחרי זמין, פרוטוקול זה מתאר כיצד להרכיב, לכייל ולהשתמש במערכת מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרראלית להפרדת אותות ממספר מקורות פלואורסצנטית במדגם אחד. בעוד שהיא ישימה מאוד לדימות מיקרוסקופיים של תאים ורקמות, טכניקה זו עשויה גם להיות שימושית עבור כל סוג של ניסוי ניצול הקרינה שבה ניתן לשנות את אורכי גל עירור, כולל אך לא מוגבל: הדמיה כימית, יישומים סביבתיים, טיפול בעיניים, מדעי המזון, מדע הזיהוי הפלילי, מדע הרפואה ומינרלוגיה.

Introduction

הדמיה ספקטרלית ניתן לבצע במגוון דרכים והוא מכונה על ידי כמה מונחים1,2,3,4. באופן כללי, הדמיה ספקטרלית מתייחסת לנתונים הנרכשים לפחות שני ממדים מרחביים ומימד ספקטרלי אחד. הדמיה רב ספקטראלית והיפרספקטקטרלית מאופיינת לרוב במספר הלהקות של אורך הגל או אם הלהקות הספקטרליות הן רציפות1. עבור יישום זה, נתונים היפרספקטקטרליים מוגדר נתונים ספקטרליים שנרכשו עם מסגרות גל רציפים שהושגו על ידי מרווח של אורכי גל מרכזי לא פחות ממחצית רוחב מלא על חצי מקסימום (FWHM) של כל מסנן בנדנה המשמש עירור (כלומר, 5 ננומטר מרווח אורך גל מרכזי עבור מסנני bandpass עם 14-20 ננומטר רוחב פס). הטבע הרציף של להקות הנתונים מאפשר דגימת יתר של ערכת המידע, ומבטיח שקריטריוני נייקוויסט יהיו מרוצים בעת דגימת התחום הספקטרלי.

הדמיה היפרספקטראלית פותחה על ידי נאס א בשנות ה-70 וה-1980 בשילוב עם לווין הראשון של landsat5,6. איסוף נתונים מכמה להקות ספקטרליות רציפות מותר לדור של ספקטרום זוהר של כל פיקסל. זיהוי והגדרה של ספקטרום הזוהר של רכיבים בודדים איפשר לא רק לזהות את חומרי השטח על ידי הספקטרום האופייני שלהם, אבל זה גם מותר להסרת אותות בהתערבות, כגון וריאציות באות בשל תנאים אטמוספריים. הרעיון של זיהוי חומרים באמצעות ספקטרום האופייני שלהם הוחל על מערכות ביולוגיות ב 1996 כאשר שרדינגר et al. בשימוש שילובים של חמישה fluorophores שונים ואת הספקטרום הידוע שלהם כדי להבדיל כרומוזומים המסומנים בתהליך כינה מקלדת ספקטרלית7. טכניקה זו פירט על ידי Tsurui ואח 2000 ‘ עבור הדמיה פלואורסצנטית של דגימות רקמה, באמצעות שבעה צבעי פלורסנט והתפרקות ערך יחיד כדי להשיג הפרדה ספקטרלית של כל פיקסל לתוך צירופים ליניאריים של ספקטרום בהפניה . ספריה8 בדומה עמיתיהם חישה מרחוק שלהם, את התרומה של כל fluorophore ידוע ניתן לחשב מן התמונה היפרספקטראלית, נתון מידע של הספקטרום של כל fluorophore.

הדמיה היפרקטרלית בשימוש גם בתחומי החקלאות9, אסטרונומיה10, ביודינין11, הדמיה כימית12, יישומים סביבתיים13, טיפול עיניים14, מזון מדע15, המדע המשפטי16,17, מדעי הרפואה18, מינרלוגיה19, ומעקבים20. מגבלה מרכזית של הנוכחי מיקרוסקופ היפרספקטקטרליות מערכות הדמיה היא כי טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית היפרקטרלית מבודד אותות זריחה להקות צר ידי 1) סינון ראשוני של אור עירור כדי לשלוט עירור המדגם, אז 2) מסנן את האור הנפלט כדי להפריד את פליטת הזריחה ללהקות צרות שיכולות להיות מופרדות מאוחר יותר21מתמטית. סינון הן התאורה העירור והזריחה הנפלטת מפחית את כמות האות הזמינה, המורידה את היחס בין האות לרעש ומחייבת זמני רכישה ארוכים. האות הנמוך וזמני הרכישה הארוכים מגבילים את הישימות של הדמיה היפרספקטראלית ככלי אבחון.

מודאליות הדמיה פותחה שעושה שימוש בהדמיה היפרקטרלית אבל מגביר את האות הזמין, ובכך לצמצם את זמן הרכישה הדרוש21,22. זה חדש מודאליות, שנקרא עירור-סריקה היפרספקטקטרלית, רוכשת נתונים התמונה ספקטרלית על ידי שינוי אורך הגל ואיסוף מגוון רחב של אור נפלט. זה כבר הוכח כי טכניקה זו מניבה הזמנות של עליות גודל ביחס אות לרעש בהשוואה לטכניקות סריקה פליטה21,22. הגידול ביחס אות לרעש הוא במידה רבה בשל המעבר ברוחב (~ 600 nm) של אור פליטה זוהה, בעוד הספציפיות מסופק על ידי סינון רק אור עירור במקום פליטת הזריחה. זה מאפשר את כל האור הנפלט (עבור כל גל עירור) כדי להגיע לגלאי21. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפלות את הקרינה האוטומטית מתוויות אקסוגני. יתר על כן, את היכולת להפחית את זמן הרכישה בשל האות מוגבר לגילוי מפחית את הסכנה של הלבנת, כמו גם מאפשר סריקות ספקטרליות בקצב הרכישה מקובל עבור דימות וידאו ספקטרלי.

המטרה של פרוטוקול זה היא לשמש כמדריך לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. בנוסף, כלולים תיאורים המסייעים להבנת הנתיב האור והחומרה. תואר גם הוא יישום של תוכנה מקור פתוח עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. לבסוף, התיאורים מסופקים לאופן הכיול של המערכת לתקן הניתן למעקב נשים, להתאים הגדרות תוכנה וחומרה לקבלת תוצאות מדויקות ולבטל את הערבול של האות המזוהה לתרומות מרכיבים בודדים.

Protocol

1. הגדרת התקן מקור אור: לבחור מקור רחב הלהקה אור ספקטרלי עם התפוקה הגבוהה החשמל ואת המקור גבוה (300 W Xe מנורת arc שימש למחקרים אלה). תריס (אופציונלי): להוסיף תריס על הנתיב האופטי כדי להפחית את הלבנת התמונה עבור הדמיה זמן. מערכת מסנן tunable: לשלב הרכבה כוונון מכני ו-סרט דק מסנן tunable (TFTF) …

Representative Results

מספר צעדים חשובים מפרוטוקול זה נחוצים כדי להבטיח את אוסף הנתונים שהוא גם מדויק ונטול הדמיה וחפצים ספקטרליות. דילוג על שלבים אלה עלול לגרום לנתונים הנראים משמעותיים אך לא ניתן לאמת או לשכפל עם כל מערכת הדמיה ספקטרלית אחרת, ובכך לבטל את כל המסקנות שנעשו עם הנתונים אמר. הראש…

Discussion

השימוש האופטימלי של הגדרת הדמיה היפרספקטקטרלית בסריקת עירור מתחיל בבניית הנתיב האור. בפרט, בחירה של מקור אור, מסננים (tunable ו דיקרואיק), החלפת מסנן שיטה, ומצלמה לקבוע את טווח ספקטרלי זמין, מהירות סריקה אפשרית, הרגישות גלאי, ודגימה מרחבית. מנורות מרקורי קשת מציעים רבים באורך גל הפסגות אבל לא מ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתמיכה של NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, וקרן אברהם מיטשל לחקר הסרטן.

Materials

Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O’Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O’Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. 생화학. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. . . Spectral Unmixing Plugins. , (2006).
  35. . . Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, . Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. . . Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. . . Comparison with other microscopy software – Micro-manager. , (2012).

Play Video

Cite This Article
Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

View Video