Floresan Sinyallerini Etkin Bir Şekilde Ayırt Etmek Için Uyarma-Tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu
Summary
Spektral görüntüleme, birden fazla floresan sinyalin tek bir örnekte tanımlanması ve ayrılması için güvenilir bir çözüm haline gelmiştir ve ilgi sinyallerini arka plandan veya otofloresanstan kolayca ayırt edebilir. Uyarma-tarama hiperspektral görüntüleme aynı anda sinyal-gürültü oranını artırırken gerekli görüntü edinme süresini azaltarak bu tekniği geliştirir.
Abstract
Çeşitli teknikler, fenomenleri tanımlamak veya incelemek veya işlevleri açıklamak için floresan sinyallerinin algılanmasına dayanır. Bu floresan sinyallerinin ayrılması, floresan kaynaklarının birbirlerinden, arka plan sinyalleri ve otofloresanlardan ayrılabildiği hiperspektral görüntülemenin ortaya çıkmasına kadar hantal olduğu kanıtlanmıştır (spektral bilgileri ne kadar dır? imzalar). Ancak, geleneksel, emisyon taramalı hiperspektral görüntüleme, hem uyarma hem de emisyon ışığının gerekli filtrelenmesi nedeniyle yavaş edinim süreleri ve düşük sinyal-gürültü oranlarından muzdariptir. Daha önce uyarma taramalı hiperspektral görüntülemenin gerekli kazanım süresini kısaltırken aynı zamanda elde edilen verilerin sinyal-gürültü oranını artırdığı gösterilmiştir. Ticari olarak kullanılabilen ekipmanı kullanan bu protokol, tek bir örnekteki birkaç floresan kaynaktan gelen sinyallerin ayrılması için uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme mikroskobu sisteminin nasıl monte edilebildiğini, kalibre edilebildiğini ve kullanılacağını açıklar. Hücrelerin ve dokuların mikroskobik görüntülemesi için son derece geçerli olmakla birlikte, bu teknik, uyarma dalga boylarını değiştirmek mümkün olan floresan kullanan her türlü deney için de yararlı olabilir: kimyasal görüntüleme, çevre uygulamaları, göz bakımı, gıda bilimi, adli tıp, tıp bilimi ve mineraloji.
Introduction
Spektral görüntüleme çeşitli şekillerde yapılabilir ve çeşitliterimler1,2,3,4ile adlandırılır. Genel olarak, spektral görüntüleme en az iki mekansal boyut ve bir spektral boyutta elde edilen verileri ifade eder. Multispektral ve hiperspektral görüntüleme en sık dalga boyu bantlarının sayısı veya spektral bantların bitişik olup olmadığı ile ayırt edilir1. Bu uygulama için hiperspektral veriler, uyarma için kullanılan her bandpass filtresinin yarım maksimum (FWHM) tam genişliğinin yarısından az olmayan merkez dalga boylarının aralıkları ile elde edilen bitişik dalga boyu bantları ile elde edilen spektral veriler olarak tanımlanır (örn. 5 nm 14-20 nm bant genişlikli bandpass filtreler iã§in merkez dalga boyu sÃ1/4releri). Veri bantlarının bitişik yapısı, veri kümesinin aşırı örneklemesine olanak sağlayarak, spektral etki alanını örneklemede Nyquist ölçütlerinin karşılanmasını sağlar.
Hiperspektral görüntüleme NASA tarafından 1970’li ve 1980’li yıllarda ilk Landsat uydusu 5 ile birlikte geliştirilmiştir5,6. Birkaç bitişik spektral banttan veri toplamak, her pikselin parlak spektrumunun oluşmasına olanak sağladı. Tek tek bileşenlerin parlaklık spektrumunun tanımlanması ve tanımlanması, yüzey malzemelerinin karakteristik spektrumları tarafından algılanmasının yanı sıra, sinyaldeki değişimler gibi müdahale eden sinyallerin de atmosferik koşullar. Karakteristik spektrumlarını kullanarak malzemelerin saptanması kavramı 1996 yılında Schröck ve ark. beş farklı floroforve bilinen spektrumların kombinasyonlarını kullanarak etiketli kromozomları bir süreç olarak adlandırıldığında biyolojik sistemlere uygulanmıştır. spektral karyotipleme7. Bu teknik 2000 yılında Tsurui ve ark. tarafından doku örneklerinin floresan görüntülemesi için, yedi floresan boya ve tekil değer ayrışması kullanılarak, her pikselin referanstaki doğrusal spektrum kombinasyonlarına spektral ayrıştırma elde edilmesi için ayrıntılı olarak geliştirilmiştir. kütüphane8. Uzaktan algılama benzerlerine benzer şekilde, bilinen her floroforun katkısı hiperspektral görüntüden hesaplanabilir, her florofor spektrumunun priori bilgileri göz önüne alındığında.
Hiperspektral görüntüleme de tarım alanlarında kullanılmıştır9, astronomi10, biyotıp11, kimyasal görüntüleme12, çevresel uygulamalar13, göz bakımı14, gıda bilimi15, adli tıp16,17, tıp bilimi18, mineraloji19, ve gözetim20. Mevcut floresan mikroskop hiperspektral görüntüleme sistemlerinin önemli bir sınırlamastandart hiperspektral görüntüleme teknolojisi dar bantlarda floresan sinyalleri izole 1) ilk örnek uyarma kontrol etmek için uyarma ışığı filtreleme, daha sonra 2) daha fazla filtreleme daha sonra matematiksel olarak 21 ayrılabilir dar bantlarhalinde floresan emisyon ayırmak için yayılan ışık . Hem uyarma aydınlatmasını hem de yayılan floresanları filtrelemek, mevcut sinyal miktarını azaltır, bu da sinyal-gürültü oranını düşürür ve uzun edinme süreleri gerektirir. Düşük sinyal ve uzun edinme süreleri, hiperspektral görüntülemenin tanı aracı olarak uygulanabilirliğini sınırlar.
Hiperspektral görüntülemekullanan ancak mevcut sinyali artıran bir görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir, böylece gerekli edinme süresini kısaltır21,22. Uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme adı verilen bu yeni yöntem, uyarma dalga boyunu değiştirerek ve geniş bir yayılan ışık aralayarak spektral görüntü verilerini elde eder. Daha önce bu tekniğin emisyon tarama teknikleri21,22ile karşılaştırıldığında sinyal-gürültü oranı büyüklük artışları siparişleri verimleri gösterilmiştir. Sinyal-gürültü oranındaki artış büyük ölçüde tespit edilen geniş bantgeçişinden (~600 nm) kaynaklanırken, özgüllük floresan emisyon yerine sadece uyarma ışığının filtrelanmasıyla sağlanır. Bu, yayılan tüm ışığın (her uyarma dalga boyuiçin) dedektör21’e ulaşmasını sağlar. Ayrıca, bu teknik eksojen etiketlerden otofloresans ayırt etmek için kullanılabilir. Ayrıca, artan tespit edilebilir sinyal nedeniyle edinme süresini kısaltma yeteneği fotobeyazrlama tehlikesini azaltır yanı sıra spektral video görüntüleme için kabul edilebilir bir edinim hızında spektral taramaları sağlar.
Bu protokolün amacı, hiperspektral görüntüleme mikroskobu için bir veri toplama rehberi olarak hizmet vermektir. Buna ek olarak, ışık yolunu ve donanımı anlamanın yolunu anlamaya yardımcı olan açıklamalar da dahildir. Ayrıca açıklanan bir uyarma tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu için açık kaynak yazılım uygulamasıdır. Son olarak, sistemin NIST tarafından izlenebilir bir standarda göre nasıl kalibre edilemeyeceği, doğru sonuçlar için yazılım ve donanım ayarlarını ayarlama ve algılanan sinyali tek tek bileşenlerin katkılarına karıştırması için açıklamalar sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme kurulumunun en iyi kullanımı ışık yolunun inşası ile başlar. Özellikle, ışık kaynağı seçimi, filtreler (tunable ve dichroic), filtre anahtarlama yöntemi ve kamera mevcut spektral aralığı, olası tarayın hızı, dedektör hassasiyeti ve mekansal örnekleme belirler. Cıva ark lambaları birçok uyarma dalga boyu zirveleri sunuyoruz ama düz bir spektral çıkış sağlamaz ve bir NIST izlenebilir yanıt geri spektral görüntü verilerini düzeltmek için ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 ve İbrahim Mitchell Araştırma Fonu’ndan destek almak istiyorum.
Materials
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
References
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
- Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
- Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
- Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
- Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
- Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
- Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
- Hege, E. K., O’Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
- Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
- Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
- Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
- Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
- Gowen, A., O’Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
- Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
- Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
- Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
- Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
- Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
- Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
- Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
- Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
- Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
- Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
- Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. 생화학. 44 (42), 13771-13782 (2005).
- Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
- Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
- Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
- Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
- Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
- Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
- . . Spectral Unmixing Plugins. , (2006).
- . . Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , (2006).
- Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
- Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
- Microscopy Key, . Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , (2016).
- Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
- . . Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , (2019).
- Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
- Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
- Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
- Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
- Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
- Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
- . . Comparison with other microscopy software – Micro-manager. , (2012).
