在这里, 我们提出了一个协议, 以提取, 解决和识别线粒体超级复合物, 最大限度地减少接触洗涤剂和库马西蓝。该协议提供了分辨率和酶活性保存之间的最佳平衡, 同时最大限度地降低了失去不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的风险。
氧化磷酸化机械的配合物形成了超分子蛋白排列名为超复合物 (Sc), 这被认为是赋予线粒体结构和功能优势。从酵母到哺乳动物, 许多物种都发现了 Sc, 越来越多的研究报告说, 它们的组织在遗传和后天人类疾病方面受到干扰。因此, 越来越多的实验室对分析 SCs 感兴趣, 这在方法上具有挑战性。本文提出了一个优化的协议, 该协议结合了蓝色和透明原生 PAGE 方法的优点, 以一种具有时间有效的方式解析和分析 SCs。利用这种混合的 CN/BN-PAGE 方法, 用最佳数量的温和洗涤剂数字素提取的线粒体 Scs 在电泳开始时被短暂地暴露在阴离子染料 Coomassie Blue (CB) 中, 而不会接触到其他洗涤剂。这种短暂的接触 CB 可以像传统的 BN-PAGE 方法一样有效地分离和解决 Sc, 同时避免高 CB 水平对凝胶活性检测的负面影响, 以及 SCs 内不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。因此, 通过该协议, 可以将凝胶活性测量中的精确和快速与涉及二维电泳、免疫检测和蛋白质组学的分析技术结合起来, 对 SCs 进行高级分析。
线粒体通过氧化磷酸化产生能量, 其中呼吸复合物 I-III-III-IV 氧化基板并将电子转移到氧气中, 产生允许 ATP 合成酶 (CV) 磷酸化 ADP 的梯度。在过去几年中, 广泛的研究表明, 呼吸链复合物不仅以线性的方式纳入线粒体内膜, 而且还被组织成超复合物 (sc) 安排1,2。在哺乳动物线粒体中, Sc存在于不同的化学特征中: CI/III 2/siv 1-4 (称为呼吸器 , 能够在体外进行 nadh:o2 氧化还原)2、CI/CIII 2 和ciii2siv1 – 23,4。此外, 呼吸复合物在其自由形态和在册种姓安排之间以不同的比率分布。因此, 据估计, 85%-100% 的 CI, 55%-65% 的 CIII, 15%-25% 的 CIV 是在 SCs4。这些超分子结构被认为可以减少 ROS 的产生, 稳定或协助单个复合物的组装, 调节呼吸链活动, 并防止蛋白质聚集在蛋白质丰富的线粒体膜5 ,6,7,8。他们的重塑能力根据能源需求的变化和他们在疾病的发病机制的重要性正在调查几个实验室 3,7,9,10,11,12,13,14. 研究表明, sc 组装中的病理改变存在于各种疾病中, 包括但不限于心磷脂合成中的遗传缺陷15、心力衰竭16、缺血再灌注17例, 糖尿病12例, 老年18 例。
本地电泳和免疫检测在 sc 研究中被广泛应用于解决 oxphos 复合物的第四纪安排2,19,20,21。本地电泳可以进一步结合特定的凝胶活性检测或 2d-sds page 页, 以实现精确的分子测定的各种 sc 组件1,19。研究 SCs 的能力在很大程度上取决于提取条件, 包括所使用的洗涤剂的类型和浓度、离子强度和 pH 值, 以及电泳迁移条件, 其中包括缓冲液组成、CB、凝胶的存在大小和丙烯酰胺百分比2。
协议和 Sc 波段分辨率在论文之间差别很大, 因此难以比较研究和方法的调整挑战22。因此, 本文提出了一种用非离子洗涤剂数字素从不同来源的分离线粒体中提取 Sc 的可靠、最优的方法, 并解决了高分子量 SCs 带的问题。优化的洗涤剂浓度、提取缓冲液的组成以及样品制备中不存在库马西蓝, 最大限度地减少了蛋白质复合物的破坏。该协议 (参见图 1的概述) 结合了 CN-PAGE 和 bn-page, 以优化大凝胶上的 sc 组件分辨率, 并与凝胶内活性检测兼容, 以便更好地显示反应带, 以及使用免疫检测的详细分析 Sc 的安排和组成。
正在积极研究线粒体超级复合物, 以阐明它们的生理作用及其在许多人类疾病发病机制中的重要性, 无论是后天或遗传线粒体疾病3,7,9,10,11,12,13,14. 为了取得可靠的结果, 需要考虑几个方面。该协议已在小鼠肝脏线粒体、小鼠骨骼肌线粒体 (未显示结果)、大鼠心脏线粒体和人成纤维细胞线粒体 (未显示结果) 中进行了测试, 但肯定可以适应其他孤立来源线粒体。该方法最佳地结合了 bn 和 cn-page 协议的各个方面, 与已发布的协议20、27、28相比, 可将接触洗涤剂和阴离子化合物的风险降至最低。
样品制备
样品制备是成功分离 Sc 的关键一步. 应仔细选择缓冲液组合, 以实现蛋白质和蛋白质组件的适当增溶, 同时尽可能保持其功能和结构的完整性。提取缓冲液的离子强度和 pH 值是需要考虑的两个重要因素。盐浓度过低 (< 50 mM K-etate 或 NaCl) 会导致蛋白质在非离子洗涤剂存在下的增溶性较差, 而超过 500 mM 的盐浓度将促进蛋白质堆叠聚集, 并沉淀 cb 和蛋白质29。因此, 应使用近生理离子强度的缓冲液提取 Sc。关于 pH 值, 建议使用接近生理 pH 值。
洗涤剂类型和洗涤剂蛋白质比对于最佳的 SC 提取也是至关重要的。为了最大限度地保存原生的 SCs, 数字素是首选26。如本议定书和其他已公布的方法23、30、31、32所示, 这种温和的洗涤剂保留了多个 sc 组件的超分子组成, 以及二聚体和ATPsynthase 的寡聚结构 (图 3和图 4)。滴定不同数量的数字素的样品是至关重要的, 以确定条件, 允许最佳的增溶, 同时保持酶活性和生理蛋白质相互作用。滴定应在2至 8 g/26 之间进行滴定.分别用4、5和6克数清蛋白获得肝脏、骨骼肌和心脏线粒体的最佳结果。需要注意的是, 数字素可以被 Triton X-100 所取代, 在最佳条件下, 它会产生与数字素2观察到的类似的迁移和 sc 成分。但是, 应谨慎使用这种洗涤剂, 因为洗涤剂/蛋白质比率的相对较小的增加 (例如, 从1到 1.5 g/g) 可能导致 SCs 组件2的完全离解, 这可能导致实验不一致。提取后, 传统上补充样品与库马西蓝, 以给予蛋白质时, 应用于凝胶, 除了传统的 cn-page20,26。为了最大限度地减少蛋白质暴露于库马西蓝和不稳定的蛋白质潜在离解, 样品没有补充库马西蓝在这个协议。
电泳
CN-PAGE 和 BN-PAGE 都被用来研究线粒体 OXPHOS 复合物, 它们都有明显的优点和局限性。在 CN-PAGE 下使用的较温和条件 (主要是缺乏 CB, 具有洗涤剂样效应), 可以更好地保存 ATP 合酶在凝胶活性, 并限制高分子量 sc 和 ATP 合酶中不稳定蛋白的分离程序集26。然而, 蛋白质提取物和电泳缓冲液中缺乏阴离子染料 CB 会导致蛋白质根据其固有电荷和等电点迁移, 从而降低凝胶26内蛋白质的电泳流动性。此外, 在没有 cb 的情况下, 负电荷不足的蛋白质往往聚集在一起, 从而降低凝胶 20,26中蛋白质复合物的分辨率。为了规避这些限制, Wittig 和 Schragger20开发了所谓的高分辨率 cn-page。在该协议中, 脱氧胆酸钠 (DOC) 和各种轻度非离子洗涤剂 (DDM, Triton X100) 被添加到阴极缓冲液中, 以保持膜蛋白的溶解性, 并对蛋白质施加负电荷转移, 从而有了相当大的改进。第20号决议的执行情况。
目前的混合 CN/BN 协议的一个显著特点是, 如果没有这些洗涤剂, 可以达到类似的分辨率。在电泳开始时将 CB 瞬间加入阴极缓冲液, 足以限制蛋白质聚集, 增强凝胶中的流动性 (图 3和图 4)。因此, 这种混合技术能够出色地分辨率的不同 SC 组件和非常低或没有接触洗涤剂。CB 含量较低还可以更好地保持 CV 活性, 更好地保存二聚体和寡聚 cv 组件 (图 3和 Wittig 和 Schägger 200526), 并减少蓝色背景噪音, 从而降低蓝色背景噪音。阻碍凝胶活性的定量, 特别是 CII 和 CIV (图 2)。此外, 蛋白质提取物中缺乏 CB 限制了 Sc 内不稳定蛋白质相互作用的破坏。例如, ATP 合酶与 ANT 形成合成物33或使用环磷素-d 调节 ptp 开口34的物理关联, 在没有 cb 的情况下表现得更好。因此, 仅在电泳过程中瞬间接触 CB 可能有助于揭示 Sc 内部新的蛋白质相互作用. 总体而言, 这种混合的 cn/bn-page 协议允许将凝胶活性测量中的精确和快速与分析结合起来用于 Scs 高级分析的二维电泳、免疫检测和蛋白质组学技术。应当指出的是, 随着人们对 Sc 的兴趣越来越大, 越来越多的研究将 10 x 10 厘米的小凝胶用于原生 PAGE。虽然这种方法可能足以确定丰度 SC 组件的总体变化, 但小凝胶的较低分离能力可能仅限于解决细微的重新排列或切断不同的带进行蛋白质组学分析。此外, 一些使用较小凝胶的研究报告说, 呼吸酶的迁移大小与 ATPsynthase 二聚体相同, 因此很难将其分离 22.因此, 应赞成使用大型凝胶。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢 Jenna Rossi 的技术援助, 感谢 Mireille Khacho 博士、David Patten 博士和 Ujval Anil Kumar 博士在开发这种方法时进行的有益讨论。这项工作由加拿大卫生研究所和加拿大国家科学和工程理事会资助。AC 是博士奖的获得者-弗雷德里克·班廷和查尔斯最佳加拿大研究生奖学金 (CIHR)。
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
Acrylamide | Sigma | A3553 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
Imidazole | Sigma | I0250 | |
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |