الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة
Summary
هنا نقدم بروتوكولا لاستخراج وحل وتحديد المجمعات الميتوكوندريا التي تقلل من التعرض للمنظفات و كوماسي Blue. هذا البروتوكول يوفر التوازن الأمثل بين القرار, والحفاظ علي أنشطه الانزيم, مع التقليل من خطر فقدان التفاعلات بروتين البروتينية العطوب.
Abstract
المجمعات من آلات فوسفولات الاكسده شكل البروتين الجزيئي ترتيبات المسمية المجمعات (SCs) ، والتي يعتقد ان تضفي المزايا الهيكلية والوظيفية إلى الميتوكوندريا. وقد تم تحديد المجموعات المنبوذة في العديد من الأنواع ، من الخميرة إلى الثدييات ، وعدد متزايد من الدراسات التقرير عن تعطيل تنظيمها في الامراض الوراثية والمكتسبة البشرية. ونتيجة لذلك ، فان عددا متزايدا من المختبرات مهتمة بتحليل المجموعات المنبوذة ، التي يمكن ان تكون صعبه من الناحية المنهجية. تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل الذي يجمع بين مزايا الأزرق-و الصفحات الاصليه مسح أساليب لحل وتحليل SCs بطريقه فعاله من حيث الوقت. مع هذا الهجين CN/BN-صفحه الأسلوب ، يتم تعريض المنبوذين الميتوكوندريا المستخرجة مع الكميات المثلي من ديجيتونين المنظفات معتدل لفتره وجيزة إلى صبغ انييوني كوماسي الأزرق (CB) في بداية الكهربائي ، دون التعرض لغيرها من المنظفات. هذا التعرض القصير إلى CB يسمح لفصل وحل SCs بشكل فعال كما هو الشان مع أساليب BN-PAGE التقليدية ، مع تجنب التاثير السلبي لمستويات CB عاليه علي اختبارات النشاط في هلام ، والتفاعلات البروتين والبروتين عطوب داخل SCs. مع هذا البروتوكول فمن الممكن الجمع بين دقيق وسريع في قياسات النشاط هلام مع التقنيات التحليلية التي تنطوي علي 2D الكهربائي ، والكشف عن المناعة ، و/أو بروتينيه للتحليل المتقدم من SCs.
Introduction
الميتوكوندريا إنتاج الطاقة من خلال فوسفولات الاكسده ، حيث المجمعات التنفسية الأول-الثاني-الثالث-IV أكسده ركائز ونقل الكترونات إلى الأكسجين ، وتوليد التدرج الذي يسمح فوسفولات ADP بواسطة synthase ATP (CV). في السنوات الماضية ، أظهرت الدراسات المستفيضة ان المجمعات التنفسية لا تدمج فقط بطريقه خطيه في غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، بل يتم تنظيمها أيضا في ترتيبات المجمعات الفائقة (SCs)1،2. في الميتوكوندريا الثدييات ، توجد SCs في ستويتشيوميتريس متفاوتة: CI/CIII2/1-4 المركز المذكور (الذي يسمي التنفس ، والتي هي قادره علي nadh: O2 الاختزال في المختبر)2، ci/ciii2، و ciii2 /1-2العدد 3،4. وعلاوة علي ذلك ، توزع المجمعات التنفسية تحت نسب مختلفه بين شكلها الحر وترتيبات SCs. ولذلك ، فانه يقدر ان 85 ٪-100 ٪ من CI ، 55 ٪-65 ٪ من CIII ، و 15 ٪-25 ٪ من المركز العام للمرطبات وجدت في SCs4. ويعتقد ان هذه الهياكل الجزيئية لخفض إنتاج الروس ، استقرار أو مساعده في تجميع المجمعات الفردية ، وتنظيم النشاط سلسله الجهاز التنفسي ، ومنع تراكم البروتين في البروتين الغنية غشاء الميتوكوندريا الداخلية5 ،6،7،8. ويجري التحقيق في قدرتها علي أعاده النمذجة علي الاختلاف في الطلب علي الطاقة وأهميتها في التسبب في الامراض في عده مختبرات3،7،9،10، 11 , 12 , 13 , 14. وقد أظهرت الدراسات ان التغيرات المرضية في الجمعية SCs موجودة في مجموعه متنوعة من الاضطرابات ، بما في ذلك ، ولكن لا تقتصر علي ، عيب وراثي في التوليف cardiolipin15، فشل القلب16، نقص التروية-ضخ17، السكري12، والشيخوخة18.
وتستخدم علي نطاق واسع الكهربائية المحلية والمناعية في الدراسات SCs لحل المجمعات oxphos الترتيبات الرباعية2,19,20,21. ويمكن كذلك ان يتم الجمع بين الكهربائي الأصلي مع محدده في اختبارات النشاط هلام أو 2d-SDS الصفحة لتمكين التحديد الجزيئي الدقيق لمختلف الجمعيات SCs1,19. القدرة علي دراسة SCs يعتمد بشكل حاسم علي ظروف الاستخراج ، بما في ذلك نوع وتركيز المنظفات المستخدمة ، والقوه الايونيه ودرجه الحموضة ، وكذلك علي ظروف الهجرة الكهربائية ، والتي تشمل تكوين العازلة ، وجود CB ، هلام الحجم ، ونسبه الاكريلاميد2.
البروتوكولات والنطاق SCs القرار تختلف اختلافا كبيرا بين الأوراق ، مما يجعل المقارنة بين الدراسات صعبه والتكيف مع الأساليب الصعبة22. ولذلك ، تقترح هذه الورقة بروتوكول قوي والأمثل لاستخراج SCs من الميتوكوندريا معزولة من مصادر مختلفه مع ديجيتونين المنظفات غير الايونيه ، ولحل العصابات SCs الوزن الجزيئي عاليه. تركيز المنظفات الأمثل ، وتكوين المخزن المؤقت الاستخراج ، وعدم وجود كوماسي Blue في اعداد العينة تقليل تعطيل مجمعات البروتين. هذا البروتوكول (انظر الشكل 1 للحصول علي نظره عامه) يجمع بين CN-الصفحة و BN-الصفحة للحصول علي الأمثل الجمعيات SCs القرار علي هلام كبير ، ومتوافق مع اختبارات النشاط في هلام السماح أفضل التصور من العصابات التفاعلية ، مع استخدام المناعي لتحليل مفصل ترتيبات SCs وتكوينها.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويجري بنشاط دراسة المجمعات المتقدريه لتوضيح دورها الفسيولوجية, وأهميتها في التسبب في الامراض البشرية العديدة, ما إذا كانت المكتسبة أو امراض الميتوكوندريا الوراثية3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-ومن أجل الحصول علي نتائج موثوق بها ، يلزم النظر في عده جوانب. وقد تم اختبار هذا البروتوكول مع الميتوكوندريا الكبد الماوس, الماوس الميتوكوندريا الهيكل العظمي العضلات (النتائج لم تظهر), الميتوكوندريا القلب الفئران, والإنسان الميتوكوندريا الليفية (النتائج لم تظهر), ولكن يمكن بالتاكيد ان تتكيف مع مصادر أخرى معزولة الميتوكوندريا. وتجمع الطريقة المثلي بين مختلف جوانب بروتوكولات المليارات والصفحات التي تسمح بتقليل التعرض لمنظفات ومركبات الانيوني إلى الحد الأدنى مقارنه بالبروتوكولات المنشورة20و27و28.
اعداد العينات
يمثل اعداد العينات خطوه حاسمه للفصل الناجح بين المجموعات المنبوذة. وينبغي اختيار تكوين العازلة بعناية من أجل تحقيق الاذابه السليمة من البروتينات والبروتينات الجمعيات ، مع الحفاظ علي قدر الإمكان وظيفية والسلامة الهيكلية. القوه الايونيه ودرجه الحموضة في المخزن المؤقت للاستخراج هما عاملان هامان يجب مراعاتهما. تركيزات الملح التي هي منخفضه جدا (< 50 mM K-خلات أو كلوريد الصوديوم) سوف يؤدي إلى الذوبان الفقراء من البروتينات في وجود المنظفات غير الايونيه ، في حين ان تركيزات الملح فوق 500 mM سوف تعزز البروتين التراص/التجميع ، وهطول الامطار من CB البروتينات29. ولذلك يجب استخراج SCs باستخدام المخازن المؤقتة بالقرب من قوه الايونيه الفسيولوجية. وفيما يتعلق بدرجه الحموضة ، يوصي باستخدام درجه الحموضة الفسيولوجية القريبة.
نوع المنظفات والمنظفات/نسبه البروتين هي أيضا حاسمه لاستخراج SC الأمثل. للحفاظ علي القصوى من SCs الاصليه ، ويفضل ديجيتونين26. كما هو مبين في هذا البروتوكول وغيرها من الأساليب المنشورة23,30,31,32, هذا المنظفات معتدل يحافظ علي التركيب الجزيئي للجمعيات SC متعددة, وديميريك هيكل اوليغروماريك من ATPsynthase (الشكل 3 والشكل 4). المعايرة من العينات من الفائدة مع كميات مختلفه من ديجيتونين أمر بالغ الاهميه من أجل تحديد الظروف التي تسمح الذوبان الأمثل ، مع الحفاظ علي نشاط الانزيم وتفاعلات البروتين الفسيولوجية. وينبغي ان يتم المعايرة مع نسب تتراوح بين 2 و 8 ز/ز26. النتائج المثلي للكبد, الهيكل العظمي العضلات والقلب الميتوكوندريا يتم الحصول علي التوالي مع 4, 5, 6 ز ديجيتونين/ز البروتين. هو سوفت كنت لاحظت ان ديجيتونين يستطيع كنت استبدلت ب [تريتون] [اكس-100], اي تحت شروط مثاليه نتيجات في مماثله هجره و [سك] تركيب بما ان ان يلاحظ مع ديجيتونين2. ومع ذلك, وينبغي استخدام هذا المنظفات بحذر, منذ زيادة صغيره نسبيا في نسبه المنظفات/البروتين (علي سبيل المثال, من 1 إلى 1.5 ز/ز) يمكن ان يؤدي إلى تفكك كامل من الجمعيات SCs2, التي يمكن ان تؤدي إلى عدم تناسق التجريبية. بعد الاستخراج ، وتستكمل العينات تقليديا مع كوماسي Blue لإعطاء البروتينات تهمه عند تطبيقها علي هلام ، باستثناء التقليدية CN-صفحه20،26. من أجل تقليل التعرض للبروتين إلى الأزرق كوماسي والتفكك المحتمل للبروتينات عطوب ، لا تستكمل عينات مع الأزرق كوماسي في هذا البروتوكول.
كهربائي
وقد استخدمت كل من CN-الصفحة و BN-PAGE لدراسة مجمعات OXPHOS الميتوكوندريا ، كل واحد منهم وجود مزايا متميزة والقيود. الشروط الأكثر اعتدالا المستخدمة تحت CN-الصفحة (أساسا غياب CB ، الذي له تاثير المنظفات مثل) ، يسمح الحفاظ علي أفضل من ATP synthase في النشاط هلام ، ويحد من تفكك البروتينات عطوب في SCs الوزن الجزيئي عاليه و synthase ATP الجمعيات26. ومع ذلك ، فان عدم وجود صبغه انيوني في استخراج البروتين والمخازن المؤقتة الكهربائي يسبب البروتينات للهجرة علي أساس التهمه المتاصله ونقطه ايزوكهربائيه ، مما يقلل من التنقل الكهربي للبروتينات داخل هلام26. وعلاوة علي ذلك ، في غياب CB ، البروتينات مع تهمه سلبيه غير كافيه تميل إلى التجميع ، التالي الحد من القرار من مجمعات البروتين في هلام20،26. للالتفاف علي هذه القيود ، تم تطوير ما يسمي عاليه الدقة CN-صفحه من قبل Wittig و Schragger20. في هذا البروتوكول ، يتم أضافه وديوكسيتشولاتي الصوديوم (DOC) ومختلف المنظفات غير الايونيه خفيفه (DDM ، تريتون X100) إلى المخزن المؤقت الكاثود للحفاظ علي البروتينات الغشاء solubilized وفرض تحول الشحنة السالبة علي البروتينات ، مما يؤدي إلى تحسن كبير من القرار20.
ومن السمات المميزة للبروتوكول الهجين الحالي الخاص بالنظام المختلط انه يمكن التوصل إلى قرار مماثل بدون هذه المنظفات. أضافه لحظيه من CB إلى المخزن المؤقت الكاثود في بداية الكهربائي كافيه للحد من تراكم البروتين وتعزيز التنقل في هلام (الشكل 3 والشكل 4). ونتيجة لذلك ، تمكن هذه التقنية الهجينة دقه ممتازة من الجمعيات SC متميزة ومنخفضه جدا أو عدم التعرض للمنظفات. وجود كميات منخفضه من CB يسمح أيضا أفضل الحفاظ علي نشاط السيرة الذاتية ، وتحسين الحفاظ علي ديميريك والجمعيات السيرة الذاتية اوليغموريك (الشكل 3 و Wittig و شافغر 200526) ، والحد من الضوضاء الخلفية الزرقاء التي يمكن ان تعيق التقدير الكمي لأنشطه الهلام ، ولا سيما بالنسبة لكل من الجيل الثاني والتسعون (الشكل 2). وعلاوة علي ذلك ، فان عدم وجود CB في استخراج البروتين يحد من اضطراب التفاعلات بروتين عطوب داخل SCs. علي سبيل المثال ، الرابطة المادية لل ATP synthase مع ANT لتشكيل synthasome 33 أو مع المجففة بالتجميد-D لتنظيم المنظمة فتح 34 وينظر أفضل في غياب CB. التعرض اللحظي لCB خلال الكهربائي فقط قد يكون مفيدا للكشف عن تفاعلات البروتين الجديدة داخل SCs. عموما ، هذا الهجين CN/BN-صفحه بروتوكول يسمح بالتالي للجمع بين دقيقه وسريعة في قياسات النشاط هلام مع التحليلية التقنيات التي تنطوي علي الكهربائي 2D ، المناعية الكشف و/أو بروتينيه للتحليل المتقدم لل SCs. وتجدر الاشاره إلى انه مع تزايد الاهتمام بالمجموعات المنبوذة ، فان عددا متزايدا من الدراسات يستخدم الهلام الصغير 10 × 10 سم للصفحة الاصليه. وفي حين ان هذا النهج قد يكون كافيا لتحديد التغيرات الاجماليه في تجمعات SC الوفرة ، فان القدرة المنخفضة للفصل من الهلام الصغير من المرجح ان تقتصر علي حل الترتيبات الدقيقة أو قطع نطاقات مختلفه للتحليل البروتيني. وعلاوة علي ذلك ، أفادت العديد من الدراسات التي تستخدم الهلام أصغر ان التنفس يهاجر في نفس الحجم مثل dimer ATPsynthase ، مما يجعل من الصعب ان تناي بها22. ولذلك ، ينبغي تفضيل استخدام الهلام الكبير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا جينا روسي علي المساعدة التقنية ، والدكتور ميرييل خاتشو ، والدكتور ديفيد باتن ، والدكتور اوفال أنيل كومار لمناقشه مفيده اثناء تطوير هذه الطريقة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) والمجلس الوطني للعلوم والهندسة في كندا (NSERC). AC هو المتلقي لجائزه الدكتوراه-فريدريك بانتينغ وتشارلز أفضل كندا المنح الدراسية العليا (CIHR).
Materials
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 | |
References
- Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
- Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
- Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
- Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -. E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
- Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
- Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
- Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
- Pallotti, F., Lenaz, G. . Methods in Cell Biology. 80, 3-44 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582 (2009).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Beutner, G., Porter, G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).
- Von Hagen, J. . Proteomics Sample Preperation. , 485 (2008).
- Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).
