Споро адсорбция как Nonrecombinant отображения системы для ферментов и антигены

Системы отображения направлены на представление биологически активных молекул на поверхности микроорганизмов и поиск приложений в различных областях, от промышленных до медицинских и экологических биотехнологий. В дополнение к бактериофаги^1,2 и клетки различных грамотрицательных и – положительных видов^3,4,5,6,7, также были бактериальных спор предложенный как систем отображения двух подходов^8,9.

Из-за его своеобразная структура, а именно обезвоженной цитоплазмы, в окружении ряда защитных слоев¹⁰, споро обеспечивает несколько преимуществ перед^8,на основе ФАГ – и клетки систем отображения⁹. Первое преимущество приходит от экстремальных надежности и стабильности спор на условиях, которые бы пагубным для всех других клеток^10,11. Spore отображается антигены и ферментов являются стабильными, после длительного хранения при комнатной температуре¹² и защищены от деградации при низких значениях рН и температура¹³. Второе преимущество спор является безопасность многих видов спорообразующих. B. subtilis, б. clausii, б. coagulansи несколько других видов используются во всем мире как пробиотики и были на рынке для человека или животных использования для десятилетий^14,15. Эта запись исключительных безопасности является очевидное общее требование для поверхности дисплея системы и имеет особое значение, когда система предназначена для использования человеческого или животного¹⁶. Третий важным преимуществом системы на основе spore отображения является, что она не имеет ограничений на размер молекулы, которая подвергается. В системах на базе фага, большой гетерологичных белка может повлиять на структуру капсида, в то время как в системах на базе ячейки, это может повлиять на структуру мембраны или может лимит/повредить мембраны транслокации шаг¹⁷. Защитные слои, окружающих споро состоят из более чем 70 различных белков¹⁰ и являются достаточно гибкими для того, чтобы принять большие инородные белки без каких-либо очевидной структурных дефектов или функциональными нарушениями⁸. Кроме того с обеих систем отображения на основе spore, мембраны транслокации белка гетерологичных не требуется^8,9. Действительно гетерологичных белки либо производятся в цитоплазме клеток матери и собрал на спор, который формируется в том же цитоплазме или адсорбируется на зрелых споро^8,9.

Споро отображения изначально был получен путем генетической системы инженера споро поверхности¹⁸. Эта генетическая система была основана на я) строительство гена слияние между кодирование гена для ползучих пальто белок (используется в качестве носителя) и кодирование гена белка будет отображаться – наличие сигналов транскрипционный анализ и трансляционная эндогенных Джин будет контролировать выражение fusion и ii) интеграция химерных гена в хромосоме B. subtilis предоставлять генетической стабильности. Этот рекомбинантных подход, с помощью различных белков споро поверхности как перевозчиков и направленный на различных потенциальных приложений, начиная от слизистой вакцины глюкозоизомеразы, биосенсор, биовосстановления, были отображены различные антигены и ферментов или Биоаналитические инструмент^8,13.

Совсем недавно другой подход споро дисплей был развитых¹⁹. Эта вторая система nonrecombinant и опирается на спонтанное и крайне жесткой адсорбции молекул на поверхности споро⁹. Антигены^19,20 и ферменты^13,21 эффективной отображаться и показали, что этот метод является значительно более эффективным, чем рекомбинантных. Такой nonrecombinant подход позволяет отображать белков в родной форме²⁰ и может также использоваться с газобетона, смерть споры¹⁹. Молекулярный механизм адсорбции полностью еще не выяснены. Отрицательный заряд и гидрофобность спора были предложены как соответствующие свойства для адсорбции^13,19,22. Недавно было показано, что модель белка, белка красный autofluorescent (mRFP) коралловых Discosoma, когда адсорбированные споро, смог проникнуть через поверхностные слои локализации в внутренний слой²³. Если доказана верно для других белков, внутренней локализации гетерологичных белков может объяснить их повышение стабильности при адсорбированные споры²³.

В недавнем исследовании двух ферментов, катализирующих два последовательных шагов по пути деградации xylan независимо были выставлены на спор B. subtilis и, когда инкубировали вместе, были в состоянии выполнять шаги как деградация²¹. Споры, собранные после реакции были все еще активен и способен продолжать xylan деградации при добавлении свежий субстрат²¹. Даже если потеря около 15% конечного продукта наблюдался в второй реакции²¹, многократного использования адсорбированных ферментов для одного, а нескольких шаг, реакций является дополнительное важное преимущество системы отображения споро.

²⁴ Пан et al. сообщили дополнительные подход для отображения гетерологичных белков на поверхности споро: гетерологичных белков (эндоглюканаза белок и бета галактозидазы, один) производится в ячейке мать во время заспорение были спонтанно заключенная в формирование пальто споро, без необходимости перевозчика. Эта система отображения дополнительных spore является сочетание двух подходов, изложенных до настоящего времени. Действительно, это рекомбинантных, поскольку гетерологичных белки были инженерии выражаться в ячейке мать во время заспорение, в то время как их сборку в пальто было спонтанным и, следовательно, nonrecombinant²⁴. Однако эффективность отображения этого дополнительного подхода остается быть проверены и по сравнению с другими двумя подходами, используя же гетерологичных белков.

Настоящий Протокол исключает споро производственные процессы и очистки, которые были описаны подробно в другом месте²⁴. Она включает в себя адсорбции реакции, оценки эффективности адсорбции точка промокательной и Люминесцентная микроскопия, и рециркуляции адсорбированных ферментов для дополнительных реакции раундов.