Adsorción de esporas como un sistema de visualización Nonrecombinant para enzimas y antígenos
Summary
Este protocolo se centra en el uso de esporas bacterianas como una herramienta “viva” nanobiotechnologicos para adsorber moléculas heterólogas con diversas actividades biológicas. También se muestran los métodos para medir la eficiencia de adsorción.
Abstract
La espora bacteriana es una célula metabólicamente quiescente, formada por una serie de capas protectoras que rodean un citoplasma deshidratado. Esta peculiar estructura hace la espora extremadamente estable y resistente y ha sugerido el uso de la espora como una plataforma para mostrar las moléculas heterólogas. Hasta ahora, una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido en las esporas de Bacillus subtilis y de algunas otras especies, inicialmente por un enfoque recombinante y, luego, por un método sencillo y eficaz nonrecombinant. El sistema de visualización nonrecombinant se basa en la adsorción directa de moléculas heterólogas en la superficie de la espora, evitando la construcción de cepas recombinantes y la liberación de bacterias genéticamente modificadas en el medio ambiente. Las moléculas adsorbidas son estabilizadas y protegidas por la interacción con las esporas, que limita la degradación rápida de antígenos y la pérdida de actividad de la enzima en condiciones desfavorables. Una vez utilizado, enzimas esporas adsorbidos pueden ser recogidas fácilmente con una mínima reducción de la actividad y reutilizadas para rondas de reacción adicional. En este artículo se muestra cómo adsorber moléculas modelo purificada esporas de B. subtilis, cómo evaluar la eficiencia de adsorción y cómo recoger esporas usadas para reciclarlas para nuevas reacciones.
Introduction
Sistemas de visualización están dirigidos a presentar moléculas biológicamente activas en la superficie de los microorganismos y encontrando aplicaciones en diversos campos, de industrial a biotecnologías médicas y ambientales. Además de phages1,2 y las células de varios Gram-negativos – positivos y especies3,4,5,6,7, esporas bacterianas han sido propuesto como sistemas de visualización por dos enfoques8,9.
Debido a su peculiar estructura, es decir, un citoplasma deshidratado rodeado por una serie de capas protectoras10, la espora proporciona varias ventajas sobre phage y celular basado en pantalla sistemas8,9. Una primera ventaja viene de la extrema robustez y estabilidad de las esporas en las condiciones que serían perjudiciales para todos otros células10,11. Enzimas y antígenos aparecen esporas son estables después de prolongado almacenamiento a temperatura ambiente12 y protegido de la degradación a pH bajo y altas temperaturas13. Una segunda ventaja de las esporas es la seguridad de muchas especies formadoras de esporas. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansy varias otras especies se utilizan como probióticos y han estado en el mercado para uso humano o animal por décadas14,15. Este expediente excepcional de seguridad es un requisito general obvio para un sistema de visualización superficial y es de particular relevancia cuando el sistema está diseñado para uso humano o animal16. Una tercera ventaja importante de un sistema de visualización basado en esporas es que no tiene limitaciones para el tamaño de la molécula que tiene que ser expuesto. En sistemas basados en el fago, una gran proteína heteróloga puede afectar la estructura de la cápside, mientras que en sistemas basados en celular, puede afectar la estructura de la membrana o límite/perjudiquen la membrana desplazamiento paso17. Las capas protectoras alrededor de la espora se componen de más de 70 diferentes proteínas10 y son lo suficientemente flexibles como para aceptar grandes proteínas extrañas sin ningún defecto estructural evidente o debilitación funcional8. Además, con ambos sistemas de visualización basado en esporas, el desplazamiento de la membrana de la proteína heteróloga no es necesario8,9. De hecho, proteínas heterólogas son producidas en el citoplasma de la célula madre y montadas en la espora que se forma en el mismo citoplasma o fijado por adsorción en la espora madura8,9.
Visualización de esporas se obtuvo inicialmente mediante el desarrollo de un sistema genético para diseñar la superficie de la espora18. Este sistema genético se basa en) la construcción de una fusión génica entre el gen que codifica para una proteína de la capa de espora (utilizada como un portador) y el gen que codifica para que la proteína que aparece – la presencia de las señales transcripcionales y traduccional de la endógena gen controla la expresión de la fusión y ii) integración del gen quimérico en el cromosoma B. subtilis a otorgar estabilidad genética. Una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido por este enfoque recombinante, utilizando diferentes proteínas de superficie de la espora como portadores y con el objetivo de varias aplicaciones potenciales, desde vacuna mucosa biocatalítica, biosensor, biorremediación, o Bioanalytical herramienta8,13.
Más recientemente, un enfoque diferente de pantalla de spore ha sido desarrollado19. Este segundo sistema es nonrecombinant y se basa en la adsorción de moléculas sobre la superficie de la espora9espontánea y muy apretada. Los antígenos19,20 y enzimas13,21 han exhibido eficientemente y han revelado que este método es significativamente más eficiente que el recombinante. Este enfoque nonrecombinant permite la visualización de proteínas en la forma nativa20 y también puede utilizarse con autoclave, esporas de muerte19. El mecanismo de adsorción molecular ha no totalmente aclarado todavía. La carga negativa y la hidrofobicidad de la espora se han propuesto como propiedades relevantes para la adsorción13,19,22. Recientemente, se ha demostrado que una proteína modelo, la proteína roja autofluorescent (mRFP) de la coral Discosoma, cuando adsorbido a la espora, fue capaz de infiltrarse a través de las capas superficiales que se localiza en la capa interior23. Si cierto para otras proteínas, la localización interna de las proteínas heterólogas podría explicar su mayor estabilidad cuando se adsorbe a las esporas23.
En un estudio reciente, dos enzimas que catalizan dos pasos sucesivos de la vía de degradación de xilano independientemente fueron exhibidas en las esporas de B. subtilis y, cuando se incuban juntos, eran capaces de realizar ambos pasos degradación del21. Las esporas recogieron después de la reacción todavía activos y capaces de continuar la degradación de xilano con la adición de sustrato fresco21. Aunque se observó una pérdida de alrededor del 15% del producto final en la segunda reacción21, la reutilización de las enzimas adsorbidas por reacciones individuales, así como varios pasos, es una ventaja importante adicional del sistema de visualización de esporas.
Pan et al.24 informaron un enfoque adicional para visualizar proteínas heterólogas en la superficie de la espora: proteínas heterólogas (una proteína endoglucanase y una beta-galactosidasa uno) producidas en la célula madre durante la esporulación fueron espontáneamente dentro de la capa de espora formación, sin la necesidad de un operador. Este sistema de visualización de esporas adicional es una combinación de los dos enfoques descritos hasta ahora. De hecho, es recombinante ya que las proteínas heterólogas fueron diseñadas para ser expresados en la célula madre durante la esporulación, aunque su montaje dentro de la capa fue espontánea y, por tanto, nonrecombinant24. Sin embargo, la eficacia de la exhibición de este enfoque adicional queda probado y Comparado con los otros dos enfoques mediante el uso de las mismas proteínas heterólogas.
El presente Protocolo excluye los procesos de producción de esporas y purificación, que han sido descritos ampliamente en otra parte24. Incluye la reacción de adsorción, la evaluación de la eficiencia de adsorción por microscopia dot-blotting y fluorescencia, y el reciclaje de enzimas adsorbidas para reacción adicional rondas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de adsorción de esporas es muy sencillo. La reacción es estrictamente dependiente del pH del buffer de reacción y la eficiencia de adsorción es óptima a valores de pH ácido (pH 5.0 o inferior). En condiciones de pH neutro, la eficiencia de adsorción es baja, y en los valores de pH alcalino, no puede ocurrir adsorción. Adsorción óptima se obtiene con un volumen de 200 μL en tubos de 1,5 mL (o manteniendo una relación similar) en un agitador oscilante.
Adsorción es mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por “Libro di Ricerca di Ateneo” a L. Baccigalupi, título del proyecto “SP-LAY: esporas bacterianas como la plataforma live para la visualización de las proteínas”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
