Summary

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Published: March 14, 2019
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Summary

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル プレートでの化学物質とワームを治療、ビデオをキャプチャおよび毒性関連表現型を定量化する方法について説明します。

Abstract

時間がかかり、高価で、その長い寿命とメンテナンスの問題のためは、マウスやラットなどの注文の高等生物で化学物質の毒性試験を適用します。それどころか、線虫線虫(C. elegans) 毒性試験のための理想的な選択にする利点があります: 短い寿命、簡単栽培、および効率的な複製。ここでは、自動表現型プロファイリング線虫 c. エレガンスの 384 ウェル プレートでのプロトコルについて述べる。線虫みみずが液体中で化学治療、384 ウェル プレートで培養し動画、各ウェルの 33 ワーム機能に関する化学物質の影響を定量化します。実験結果は、定量化された表現型特徴できます分類し異なる化学物質の急性毒性を予測し、齧歯動物モデルでさらに伝統的な化学的毒性評価テストの優先順位を確立することを示しています。

Introduction

工業生産や人々 の日常生活に適用される化合物の急激な発展、毒性化学物質のためのモデルのテストを検討することが重要です。多くの場合、げっ歯類の動物モデルを採用して、健康に異なる化学物質の潜在的な毒性を評価します。一般に、致死濃度 (すなわち、assayed 50% 致死量 [LD50] 異なる化学物質) の微量は、時間がかかり、非常に高価である齧歯動物 (ラット/マウス) モデルでは生体内で、従来のパラメーターとして使用されます。さらに、リデュースのため調整、または、動物の福祉と倫理の中心 (3 r) 原則、科学研究1,2,3に貴重な高等動物の交換のための新しいメソッドを置き換える.線虫は土壌から分離された線虫です。それは短い寿命、簡単栽培、および効率的な複製などの有益な特性のため、研究室で研究生物として広く使用でされています。また、線虫基本的な生理学的なプロセスおよびストレス反応を含む多くの基本的な生物学的経路はより高い哺乳類4,5,6,7内に保存されます。,8します。 私たちと他の人が行った比較のカップルは、線虫の毒性と齧歯動物9において毒性との良い一致があります。これはすべて線虫体内化学物質毒性の効果をテストする良いモデル。

最近では、いくつかの研究では、線虫 c. エレガンスの表現型の特徴を定量化しました。化学物質2,3,10の毒性やワーム11の高齢化を分析する機能を使用できます。我々 はまたシステム、画像解析システム、ワームはさまざまな化学治療法12下 384 ウェル プレートで培養した培養液のワームを組み合わせた方法を開発しました。自動的に液体培地と 384 ウェル プレートの化学治療の 12-24 時間後、C. elegans の 33 のパラメーターを分析するこの量的な技術を開発しました。自動顕微鏡ステージは実験のビデオ獲得のため使用されます。ビデオは、カスタム設計のプログラムによって処理され、ワームの移動動作に関連 33 機能を定量化します。10 化合物の治療の下でワームの表現型を定量化するための方法です。異なる毒性が線虫 c. エレガンスの表現型を変えることができることを示した。識別し、異なる化学物質の急性毒性を予測するこれらの定量化された表現型を使用できます。このメソッドの全体的な目標は、観察と液体培養における線虫の実験の表現型の定量化を容易にするためにです。この方法は化学的毒性評価と異なる化合物の急性毒性を予測し、優先順位のリストに役立つ表現型数量にc. の elegansのアプリケーションの役に立つさらに伝統的なげっ歯類モデルにおける化学的毒性評価試験。さらに、このメソッドは、毒性スクリーニングと食品添加剤汚染、pharmacautical 化合物、環境の外因性化合物と新しい化学物質や化合物のテストに適用できます。

Protocol

プロトコル中国の病気予防および管理の北京センターの動物倫理委員会の動物のケアのガイドラインに従います。 1. 化学合成 化学物質 (表 1と表の材料) を取得します。 最小濃度 100% 致死 (LC100、24 h) とワームに 100 %nonlethality (LC0、24 h) の最大許容濃度の個々 の化学物質の最高と最低の量を決定します。最高濃度 (表 1) …

Representative Results

我々 は 10 以上の化学物質12の異なる濃度にさらされた線虫の表現型をテストしています。テストは、33 の特徴は各化合物 (0 h、12 h、24 h) の 3 つの時点での定量化されました。以前は、マニュアルと寿命アッセイの自動解析の比較は11,12に行われました。この分析では、化学物質と濃度がワームの表現型に?…

Discussion

線虫 c. エレガンスの利点は、毒物学9解明と高スループット スクリーニングのアプローチの両方の使用が増えたにつながっています。毒性研究の他のモデル システムを補完するのにc. の elegansの高められた役割は、近年、特に新規化学物質の急速な毒性評価で注目されています。この記事は、自動認識と化学的毒性の評価のためワームの高スループット、定量?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、CGC が親切に c. の elegans を送信することをありがちましょう。この仕事に支えられたキー研究と開発中国プログラムの (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705);中国の助成金 (#31401025、#81273108 #81641184)、資本健康研究北京 (#2011-1013-03)、北京の環境毒物学 (# の主実験室の開口部基金の特別なプロジェクトの開発の国家自然科学基金2015HJDL03) と自然科学基金、中国山東省 (ZR2017BF041)。

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

References

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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