Summary

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video’s en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Abstract

Het toepassen van toxiciteit van chemische stoffen in hogere orde organismen, zoals muizen of ratten, is tijdrovend en duur, als gevolg van hun lange levensduur en onderhoud kwesties. Integendeel, de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft voordelen zodat het een ideale keuze voor toxiciteitstests: een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Hier beschrijven we een protocol voor de automatische fenotypische profilering van C. elegans in een 384-well-plate. De nematode wormen zijn gekweekt in een 384-well plaat met vloeibare middellange en chemische behandeling en video’s zijn genomen van elk putje te kwantificeren van de chemische invloed op 33 worm functies. Experimentele resultaten aantonen dat de gekwantificeerde fenotype functies kunnen classificeren en voorspellen van de acute toxiciteit voor verschillende chemische verbindingen en een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele chemische toxiciteit assessment tests in een knaagdier model stelt.

Introduction

Samen met de snelle ontwikkeling van chemische verbindingen die zijn toegepast op de industriële productie en het dagelijks leven van mensen, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van de modellen voor de chemische stoffen. In veel gevallen is het knaagdier diermodel aangewend om te evalueren van de potentiële toxiciteit van verschillende chemische stoffen op de gezondheid. In het algemeen, wordt de bepaling van de letale concentratie (dat wil zeggen, de getest 50% letale dosis [LD50] van verschillende chemische stoffen) gebruikt als de traditionele parameter in een in vivo knaagdier (rat/muis)-model dat is tijdrovend en zeer duur. Bovendien, als gevolg van de verminderen, verfijnen of vervangen (3R)-beginsel dat is essentieel voor het welzijn van dieren en ethiek, nieuwe methoden waarmee voor de vervanging van hogere dieren zijn waardevol voor wetenschappelijk onderzoek1,2,3 . C. elegans is een free-living nematode die geïsoleerd uit bodem is. Het heeft grote schaal gebruikt als een organisme onderzoek in het laboratorium vanwege zijn gunstige kenmerken, zoals een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Daarnaast worden vele fundamentele biologische paden, met inbegrip van fundamentele fysiologische processen en stress reacties in C. elegans, bewaard in hogere zoogdieren4,5,6,7 , 8. in een aantal vergelijkingen die wij en anderen hebben gedaan, er is een goede overeenstemming tussen C. elegans toxiciteit en toxiciteit bij knaagdieren9waargenomen. Dit alles maakt C. elegans een goed model voor het testen van de effecten van chemische toxicities in vivo.

Sommige studies gekwantificeerd onlangs, de fenotypische kenmerken van C. elegans. De functies kunnen worden gebruikt om de toxicities van3,10 van de2,van de chemische stoffen en de veroudering van wormen11te analyseren. Ook ontwikkelden we een methode die een vloeibaar worm culturing systeem en een analysesysteem combineert, waarin de wormen gekweekt in een 384-well plaat onder verschillende chemische behandelingen12 zijn. Deze kwantitatieve techniek heeft ontwikkeld om te analyseren automatisch de 33 parameters van C. elegans na 12-24h van chemische behandeling in een 384-well plaat met vloeistof. Een geautomatiseerde Microscoop stadium wordt gebruikt voor experimentele video acquisitie. De video’s worden verwerkt door een speciaal ontworpen programma en 33 kenmerken in verband met de wormen bewegende gedrag worden gekwantificeerd. De methode wordt gebruikt om te kwantificeren van de worm fenotypen onder de behandeling van 10 verbindingen. Uit de resultaten blijkt dat verschillende toxicities als de fenotypen van C. elegans veranderen kunnen. Deze gekwantificeerde fenotypen kunnen worden gebruikt voor het identificeren en voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen. Het algemene doel van deze methode is de observatie en fenotypische kwantificering van experimenten met C. elegans in een vloeibare cultuur te vergemakkelijken. Deze methode is nuttig voor de toepassing van C. elegans in chemische toxiciteit evaluaties en fenotype ondermeer, die helpen bij het voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen en stelt een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele de tests van de beoordeling van het chemische toxiciteit in een knaagdier model. Bovendien, kan deze methode worden toegepast om de toxiciteit screening en het testen van nieuwe chemische producten of de verbinding als het voedsel additieve agent verontreiniging, pharmacautical verbindingen, milieu exogene stof, enzovoort.

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de dier-ethische commissie van de Peking-centrum voor ziektepreventie en -bestrijding in China. 1. chemische preparaten Verkrijgen chemicaliën (tabel 1 en Tabel van materialen). Het bepalen van de hoogste en de laagste dosering van de afzonderlijke chemische stoffen voor een minimumconcentratie van 100% letaliteit (LC100, 24 uur per dag) en een maximale concentratie van…

Representative Results

We hebben de fenotypen van wormen blootgesteld aan verschillende concentraties van meer dan 10 chemische stoffen12getest. In de test, werden 33 verschillende functies gekwantificeerd voor elke chemische verbinding op drie tijdstippen (0 h, 12 h en 24 h). Eerder, werd een vergelijking tussen een handleiding en een automatische analyse van een levensduur test gedaan11,12. In deze test vonden we dat chemische …

Discussion

De voordelen van C. elegans hebben geleid tot het toenemende gebruik ervan in de toxicologie9, zowel voor mechanistische studies en high-throughput screening benaderingen. Een grotere rol voor C. elegans in aanvulling op andere modelsystemen in toxicologisch onderzoek is opmerkelijk in de afgelopen jaren, met name voor de beoordeling van de snelle toxiciteit van nieuwe chemicaliën. Dit artikel bevat een nieuwe bepaling van hoge-doorvoer, kwantitatieve screening van worm fenotype…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken CGC kandidatuur verzenden de C. elegans. Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Nationale Natural Science Foundation van China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), de hoofdstad gezondheidsonderzoek en de ontwikkeling van speciaal Project in Peking (#2011-1013-03), het Fonds van de Opening van de Beijing belangrijkste laboratorium voor milieutoxicologie (# 2015HJDL03), en de Stichting van de natuurwetenschappen van de noordoostelijke provincie Shandong, China (ZR2017BF041).

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

References

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).

Play Video

Cite This Article
Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

View Video