このプロトコルを記述する一般的なプロセスと品質管理チェック液滴ベース、高スループット単一細胞 RNA シーケンス準備のため健康な成体哺乳類単一細胞を準備するために必要です。パラメーターのシーケンス、読み取りの配置、およびダウン ストリームの単一細胞バイオ情報解析されています。
組織や微小環境の内で個々 の細胞の何千もの単一細胞遺伝子発現の解析は識別の細胞組成、機能状態と分子経路観測組織の差別のための貴重なツール関数は、動物の行動。ただし、以降の下流の単一細胞分子解析成体哺乳類組織からそのままに、健康的な単一セルの隔離は挑戦することができます。このプロトコルは、一般的なプロセスを説明し、品質管理は神経系から高品質大人の単一細胞製剤を入手するか、皮膚に必要な有効その後公平な単一細胞 RNA シーケンスと解析をチェックします。下流のバイオ情報解析のためのガイドラインも提供されます。
高スループット単一のセル技術1,2の最後の十年3以上のユーザーフレンドリーなバイオインフォマティクス ツールの進歩発展に伴い、高解像度遺伝子発現解析の新しい分野を浮上している-単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA)。単一細胞の遺伝子発現の研究を幹細胞やがん細胞のように定義された細胞集団内の不均一性を識別するためにまたは使用不可能であったセル4、5、特殊な集団を識別するために最初に開発されました従来のばら積み RNA の配列解析技術。Bioinformatic ツールが新規のサブ集団 (スーラ)2, psuedotime スペース (モノクル)6、アクティブのシグナリング ネットワーク内または集団 (間の定義に沿って細胞の可視化の識別を有効にしています。風光明媚な)7、人工 3 D 空間 (スーラなど) の単一セルのアセンブリの予測8。新しくて刺激的な分析科学のコミュニティに利用可能、scRNA Seq は高速-なっている遺伝子発現解析のための新しい標準的なアプローチ。
ScRNA Seq の広大な潜在性にもかかわらずきれいなデータセットを生成し、結果を正確に解釈するために必要な技術的なスキルセットは新人に挑戦することができます。ここでは、基本的なしかし、包括的なプロトコル、可視化する全体主組織から単一セルの隔離およびパブリケーションのデータの提示から始まってされます (図 1)。まず、健康な単一細胞の分離とみなすことが困難な酵素消化とその後の機械的解離に対する感度の度合いで変わるさまざまな組織として。このプロトコルは分離手順のガイダンスを提供し、プロセス全体を通して品質管理の重要なチェックポイントを識別します。第二に、互換性および単一のセル技術と次世代シーケンサーと要件を理解することは混乱することができます。このプロトコルは、ユーザーフレンドリーな液滴を用いた単一細胞のバーコード プラットフォームを実装して、シーケンス処理の実行するためのガイドラインを提供します。最後に、コンピュータ ・ プログラミングは単一細胞トランスクリプトームのデータセットを分析するための重要な前提条件です。このプロトコルは、R のプログラミング言語を使うにあたってのリソースを提供し、2 つの人気 scRNA-Seq 固有の R パッケージの実装について説明します。一緒に、このプロトコルは、分析 scRNA Seq クリア、解釈の結果を取得するために初心者を導くことができます。このプロトコルはマウスのほとんどの組織に調整することができます、重要なの組織の人間を含む他の有機体で使用するために変更することが。組織とユーザーに応じて調整が必要になります。
この議定書に従いながら、留意すべきいくつかの考慮事項があります。正確な合計のセル番号のカウント (図 2 に要約を確保しながら興味のサンプル内のすべてのセルの実行可能な単一細胞懸濁液を確実に推奨は 1) 手順 1 ですべての品質管理の指針とこのプロトコルの 2 次など).これが実現すると、最適化のすべての条件に従っている場合品質管理手順で削除できます (に短縮 – RNA の品質を維持し、細胞の損失)。確認する興味の組織から高い生存率単一細胞の分離を成功させる高い下流より前に、お勧め処理しています。2) ある細胞のタイプはストレスを他の人よりも敏感なので、過剰解離手法が人口、したがって下流解析を交絡バイアスは誤って。不要な携帯電話せんと消化せず穏やかな解離が高利回り細胞および組織組成の正確な表現を実現するため重要です。巻き上がり、FACS 製粉段階でせん断力が発生します。3) として任意の RNA の作品とはそれの準備中にできるだけサンプルに少し追加 RNase として取り入れるが最善。高品質の RNA を維持に役立ちます。リボヌクレアーゼ阻害剤のソリューションを使用しクリーン ツールとではない機器を洗浄 RNase フリーが、DEPC 処理製品を避けてください。4) できるだけ早く準備を実行します。これは高品質の RNA を維持し、細胞死を削減を助けます。組織郭清の長さと動物の数、に応じて、同時に複数の解剖/準備を開始を検討します。5) 高品質 RNA を維持、細胞死を軽減し低速可能な細胞シグナル伝達と転写活性とき氷の上のセルを準備します。とはいえ、冷たい処理は、ほとんどの種類の細胞に最適です、室温で処理されるときは、ある細胞のタイプ (例えば、好中球) の方がパフォーマンスが向上します。6) セルの準備中にカルシウム、マグネシウム、EDTA、DEPC 処理製品を避けてください。
このプロトコルは、どのように単一細胞の適切な準備できる単一細胞の何千もの転写の不均一性を明らかにし、差別の機能の状態や、組織内で一意の携帯 id を示します。プロトコル蛍光レポーター蛋白質や遺伝子組換えのツールは必要ありませんし、人間からのそれらを含むさまざまな組織の単一細胞の分離に適用できます。各組織を念頭、ユニークで、このプロトコルの調整/修正の程度が必要になります。
細胞内の多様な非常にダイナミックな転写プログラムは、ゲノムの単一セルの値を強調しています。別に高品質の RNA を隔離する、質の高いデータセットに必要な重要な試料前処理は確実に細胞が組織から完全に解放されるおよび細胞、健康かつそのままであります。これは容易に細胞を収集公開、循環細胞など、細胞の保持は、組織でリンパ組織などでは比較的まっすぐ進む。しかし、これは大規模な距離、周辺の細胞外マトリックスと細胞構造を維持することに関与する多くの場合堅い細胞骨格タンパク質にまたがる高度細胞アーキテクチャのための他の成体組織のために挑戦することができます。セルの完全なリリースの技法の適切な解離とも必要な厳格なと多くの場合時間のかかる処理が mRNA の品質とセルの整合性を変更可能性があります。さらに、酵素による分解に使用される高温転写署名29,30にも影響します。プロトコルの目的は、品質管理にチェック、最適化はこれらの障害を克服するために助けることができる方法を実証する有髄の大人の神経や細胞外マトリックスの豊富な大人の皮膚などの組織を使用です。
ScRNA Seq 実験を設計する際の主要な考慮事項は、シーケンスの深さの選択です。シーケンスを高度に多重化して読み取ることがされて非常に低いドロップ Seq2最大 500 万読み取り/セル14スマート シーケンスなどフルレングス RNA シーケンスのメソッドを使用してを使用してから深さがありますほとんどの scRNA Seq 実験は、細胞型分類41,42通常十分であるシーケンス 10,000 読み取り/セル、低中程度の高式成績証明書を検出できます。浅いシーケンスの深さは、細胞の何千も特殊な集団のせいにする自信を持ってする必要があります複雑な組織で、稀な細胞集団を検出しようとしたときに、シーケンシング コストを保存する値のことです。しかし、遺伝子発現と微妙な転写署名に関連付けられたプロセスに関する詳細な情報が必要な場合、浅い深さシーケンスが不十分。現在、500,000 の読み取り/セルでセルに遺伝子の大多数が検出されたが、プロトコルによって異なりますが、組織型43,44と推定されます。フルレングスのトラン スクリプトのシーケンスがアセンブリの必要性を回避、小説や珍しいスプライスバリアントを検出できます、したがって、シーケンス コストは多くの場合複雑な組織システムを構成する細胞の数を調べて、このようなアプローチをスケーリングを制限します。対照的に、3′ タグ付きの単一セル ライブラリ通常このプロトコルで記述されているものより低い複雑さと浅くシーケンスを必要とします。5 つのサポートされているシーケンサーの 1 つで説明されているプロトコルを使用して生成されたライブラリをシーケンス処理できることに注意してくださいすることが重要です: NovaSeq 1)、2) HiSeq 3000/4000、3) HiSeq 2500 急速な実行と高出力、4) NextSeq 500/550、MiSeq 5)。
繊細な組織とまだ処理セルの必要性を削減する単一細胞 RNA シーケンスへの代替アプローチは単一細胞 RNA シーケンスの利点のいくつかを維持、単一核45から RNA の解析です。このアプローチは、RNA の劣化と核の適切なリリースを確保するためより多くの極端な措置の削減より迅速な処理を可能に、したがって可能性が高い特定の組織内のすべてのセルを表す転写プロファイルのもっと自信を持って捕獲のためことができます。もちろん、転写活性の実験的な目的がこのアプローチ可能性がありますまたは適さない場合があります興味あるものによって従って特定のセル内の一部のみ提供だろう、これ。
特定組織内の細胞のアイデンティティの完全な特性評価、ほか scRNA Seq データセットの最も貴重な分析の 1 つは ‘定義’ 細胞集団間で中間転写状態の評価です。これらの中間の状態は、伝統的な一括 RNA シーケンスのアプローチでは不可能でした特定の集団内のセル間の系列リレーションシップへの洞察力を伝えることができます。これを明らかにするいくつかの scRNA Seq bioinformatic ツールを開発されている今。このようなツールは、たとえば、がん細胞の多様な端末の運命や、静止状態との間の往復の免疫細胞に成熟幹細胞の発癌性/転移状態に移行に関与するプロセスを評価できます。細胞のトランスクリプトームの微妙な違いは、FateID のような最近開発された bioinformatic ツールが47を推論できること、血統バイアスを示す場合もあります。移行細胞の区別が難しいことができますので微妙かもしれない特定の転写の違いを確認するため、深いシーケンスが必要な46あります。幸いなことに、別のフロー ・ セルでライブラリを再実行してさらにデータセットを調査に興味がある場合、浅くシーケンスされたライブラリをカバーは増やすことができます。
一緒に取られて、このプロトコルは、発現プロファイルの 1 つの実験内の単一セルの何千もの何百もすることができます簡単に適応するためのワークフローを提供します。ScRNA Seq データセットの最終的な品質は、最適化された細胞の隔離、フローサイトメトリー、cDNA ライブラリを生成、および生遺伝子バーコード行列の解釈に依存しています。この目的のためには、このプロトコルは、多様な組織の種類の研究を有効にする簡単に変更することができますすべての重要なステップの包括的な概観を提供します。
The authors have nothing to disclose.
我々 はカルガリーの大学で動物実験施設スタッフだけでなく、UCDNA サービス施設でのサポート スタッフを認めます。バイオインフォマティクスの彼のサポートのためのマットの Workentine と彼のテクニカル サポートのイェンス Durruthy に感謝しますこの作品はバトンとアルバータ子供の健康研究所フェローシップ (バッハ) 機構の新しい賞機構助成金 (r. m. と j. b.) によって資金を供給します。
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |