이 프로토콜에서는 일반적인 프로세스를 설명 합니다 및 품질 관리 검사 드롭릿 기반, 높은 처리량 단일 셀 RNA-Seq 준비에 대 한 건강 한 성인 포유류 단일 세포를 준비에 필요한. 시퀀싱 매개 변수, 읽기 정렬 및 다운스트림 단일 셀 bioinformatic 분석 또한 제공 됩니다.
조직 또는 microenvironment 내에서 개별 셀의 수천에 걸쳐 단일 세포 유전자 발현의 분석은 식별 셀 구성, 기능 및의 밑에 관찰 된 조직 하는 분자 경로 차별 하기 위한 유용한 도구 함수 및 동물성 행동입니다. 그러나, 후속 다운스트림 단일 세포 분자 분석에 대 한 성인 포유류 조직에서 그대로, 건강 한 세포의 고립 전하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일반 프로세스 및 품질 관리 신 시스템에서 높은-품질 성인 단일 셀 준비 하거나 피부를 위해 필요한 설정 이후 편견된 단일 셀 RNA 시퀀싱 및 분석 검사. 다운스트림 bioinformatic 분석에 대 한 가이드도 제공 됩니다.
높은 처리량 단일 셀 기술1,2 와 지난 10 년간3사용자 친화적인 생물 정보학 도구 발전의 개발, 고해상도 유전자 표정 분석의 새로운 필드가 나왔다- 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq) 단일 셀 유전자 발현의 연구 처음 줄기 세포 또는 암 세포, 정의 된 세포 인구 내에서 식별 하거나 식별 어려운 사용 하는 셀의4,5, 드문 인구 개발 되었다 전통적인 대량 RNA 시퀀싱 기법입니다. 소설 부분 모집단 (Seurat)2, psuedotime 공간 (Monocle)6, 인구 (또는 내 활성 신호 네트워크의 정의 따라 셀 순서의 시각화의 식별을 가능 하 게 Bioinformatic 도구 아름 다운)7, 단일-셀 (Seurat, 그리고 더 많은) 인공 3D 공간에서의 조립의 예측8. 이러한 새롭고 흥미로운 분석 과학 지역 사회에 사용할 수 있는, scRNA-Seq 빠른-되고있다 유전자 표정 분석에 대 한 새로운 표준 접근을.
ScRNA-Seq의 광대 한 잠재력에도 불구 하 고 깨끗 한 데이터 집합을 생성 하 고 결과 정확 하 게 해석 하는 데 필요한 기술 skillsets 이민자를 전하실 수 있습니다. 여기, 기본적인, 하지만 포괄적인 프로토콜 (그림 1) 제시 시각화를 전체 기본 조직에서 단일 세포의 분리 및 게시에 대 한 데이터의 프레 젠 테이 션에서 시작 합니다. 첫째, 건강 한 세포의 격리 수 있습니다 간주 도전, 효소 소화와 후속 기계적 분리에 감도의 그들의 정도에 따라 다릅니다 다른 조직. 이 프로토콜 이러한 격리 단계에 제공 하 고 과정 전반에 걸쳐 중요 한 품질 관리 검사점을 식별 합니다. 둘째, 호환성 및 단일 셀 기술 및 차세대 시퀀싱 사이 요구 사항 이해 복잡할 수 있다. 이 프로토콜 구현 하는 사용자 친화적인, 드롭릿 기반 단일 셀 barcoding 플랫폼 및 시퀀싱을 수행 하는 지침을 제공 합니다. 마지막으로, 컴퓨터 프로그래밍은 단일 셀 transcriptomic 데이터 집합을 분석 하기 위한 중요 한 전제 조건입니다. 이 프로토콜 R 프로그래밍 언어에서 시작 하기 위한 리소스를 제공 하 고 구현 하는 두 개의 인기 있는 scRNA Seq 관련 R 패키지 지침을 제공 합니다. 함께,이 프로토콜 명확 하 고, 해석할 결과 얻기 위해 scRNA-Seq 분석 수행에 신규 이민자 가이드 수 있습니다. 이 프로토콜, 마우스에서 대부분 조직에 조정 될 수 있다 그리고 중요 한 것은 인간 직물을 포함 한 다른 유기 체와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 조직 및 사용자에 따라 조정 해야 합니다.
다음이 프로토콜; 하는 동안 마음에 계속 몇 가지 고려 사항이 포함 하 여, 정확한 요약 셀 숫자 카운트 ( 그림 2에에서 요약 하면서 관심의 샘플 내에서 모든 셀의 가능한 단일 세포 현 탁 액을 되도록 권장 1) 다음 단계 1에서 모든 품질 관리 지침과이 프로토콜의 2 ). 일단이 이루어집니다, 그리고 품질 관리 단계를 삭제할 수 있습니다 모든 최적화 된 조건을 따른다면 (에 시간-절약 RNA 품질을 유지 하 고 감소 셀 손실). 높은 생존의 조직에서 단일 세포의 성공적인 격리 확인는 매우 추천 전에 다운스트림 처리 합니다. 2) 일부 세포 유형 스트레스를 다른 사람 보다 더 민감한 때문에, 과도 한 분리 기술 인구, 따라서 다운스트림 분석을 혼동 편견 실수로 수 있습니다. 불필요 한 세포 전단 및 소화 하지 않고 부드러운 분리는 높은 세포 수율과 조직 구성의 정확한 표현을 달성 하기 위한 중요 합니다. 전단 세력 분쇄, FACS, 물의 resuspension 단계 동안 발생합니다. 3)로 모든 RNA 일 그것은 최고의 작은 추가 RNase 가능한 샘플으로 준비 하는 동안 소개 하. 이 높은-품질 RNA를 유지 하는 데 도움이 됩니다. 청소 도구 및 모든 장비는 하지 rinsing ribonuclease 억제제 솔루션 사용 RNase 무료 DEPC 처리 제품을 피 하지만. 4) 가능한 한 빨리 준비를 수행 합니다. 이 높은-품질 RNA를 유지 하 고 세포 죽음을 줄이기 위해 도움이 됩니다. 조직 절 개 길이 동물 숫자에 따라 동시에 여러 해/준비를 시작 하는 것이 좋습니다. 5)을 유지 하는 고품질 RNA, 세포 죽음, 천천히 가능한 세포 신호 그리고 transcriptional 활동 때 얼음에 셀을 준비 합니다. 이기는 하지만, 얼음 처리는 대부분 세포 유형, 실 온에서 처리 될 때 일부 세포 유형 (예를들면, 중 성구) 더 나은 수행 합니다. 6) 피하 칼슘, 마그네슘, EDTA, DEPC 처리 제품 셀 준비 중.
이 프로토콜 방법을 보여 줍니다 단 세포의 적절 한 준비 수 단일 세포의 수천의 transcriptional이 밝히기 차별 기능 상태 또는 조직 내에서 고유한 세포 id. 프로토콜과 형광 기자 단백질 또는 유전자 변형 도구를 필요로 하지 않는 인간;에서 그들을 포함 하는 관심의 다양 한 조직에서 단일 세포의 분리에 적용 될 수 있습니다. 각 조직 명심 독특한 이며이 프로토콜 조정/수정 어느 정도 필요 합니다.
세포 내에서 다양 하 고 높은 동적 transcriptional 프로그램 단일 셀 유전체학의 가치를 강조 했다. 높은-품질 RNA 분리, 이외에도 고품질 데이터 집합에 필요한 중요 한 샘플 준비 단계 세포 조직에서 발표 완전히 되 고 세포가 건강 하 고 그대로 하도록 이다. 이것은 상대적으로 곧장 앞으로 쉽게 세포를 수집 발표, 순환 셀 또는 셀 느슨하게 그대로 유지 하는 조직에 림프 조직 같이. 하지만이 다른 성인 조직, 세포 외 기질 및 자주 엄밀한 cytoskeletal 단백질 세포 구조를 유지에 관련 된 큰 거리에 걸쳐 선진국 세포질 건축 때문에 도전적 일 수 있다. 심지어 적절 한 분리에 대 한 기술로 셀의 전체 릴리스, 잠재적인 필요한 엄격 하 고 종종 긴 처리 mRNA 품질 및 셀 무결성을 변경할 것입니다. 또한, 효소를 이용한 분리에 사용 되는 높은 온도 transcriptional 서명29,30또한 영향을 미칩니다. 프로토콜의 현재 품질 관리 검사, 최적화 이러한 장애물을 극복 하는 데 도움이 수 어떻게 보여 조직 myelinated 성인 신경 및 세포 외 매트릭스 풍부한 성인 피부 등을 사용 하 여입니다.
어떤 scRNA-Seq 실험을 설계할 때 주요 고려 시퀀싱 깊이의 선택입니다. 시퀀싱을 매우 다중화 하 고 읽을 수 있는 깊이 최대 5 백만 읽기/셀14 스마트가 같은 전체 길이 RNA-Seq 방법을 사용 하 여 드롭-Seq2 를 사용 하 여 매우 낮은 것에서 변화할 수 있다 대부분 scRNA-Seq 실험은 일반적으로 셀 형식을 분류41,42에 대 한 충분 한 시퀀싱 10000 읽기/셀, 낮은과 중간에 높은 식 성적을 감지할 수 있습니다. 얕은 시퀀싱 깊이 복잡 한 조직 세포의 수천 드문 인구를 자신 있게 돌리다 필요할 어디에 걸쳐 희귀 세포 인구를 감지 하려는 경우 시퀀싱 비용에 저장 하는 값입니다. 하지만 얕은 깊이 시퀀싱 유전자 발현과 관련 된 미묘한 transcriptional 서명 프로세스에 대 한 자세한 내용은 필요한 경우 적합 하지 않습니다. 현재, 그것은 500000 읽기/셀, 셀에 유전자의 대다수는 발견 하지만이 프로토콜에 따라 다를 수 있습니다 및 조직 입력43,44추정. 전장 사본 시퀀싱 어셈블리에 대 한 필요를 circumvents 및 따라서, 소설 또는 드문 결합 이체를 검색할 수 있습니다, 하는 동안 자주 시퀀싱 비용 스케일링 복잡 한 조직 시스템을 구성 하는 세포의 수천 검토를 같은 접근 제한. 반면, 3′ 태그가 단일 셀 라이브러리와 같은 일반적으로이 프로토콜에서 설명 하는 것 들 낮은 복잡도 얕은 시퀀싱을 필요로. 5 지원된 시퀀서 중 하나에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 라이브러리의 순차를 설정할 수는 주의 하는 것이 중요 하다: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 빠른 실행 및 높은 출력, 4) NextSeq 500/550, 및 5) MiSeq.
섬세 한 조직 및 세포 아직 처리를 위한 필요를 감소 시키는 다른 접근 방법 단일 셀 RNA-Seq, 단일 셀 RNA-Seq의 혜택의 일부를 유지, 단일 핵45에서 RNA의 분석 이다. 이 이렇게는 RNA 저하, 그리고 더 많은 극단적인 조치, 핵의 적절 한 릴리스를 줄이고 더 빠른 처리를 허용 하 고 따라서 가능성이 해당된 조직 내에서 모든 셀을 나타내는 transcriptional 프로필의 자부 캡처 수 있습니다. 이 물론,만 따라서 따라 어떤 실험 목표가이 접근 하거나 적합 하지 않을 수 있습니다 관심의 특정된 셀 내에서 현재 transcriptional 활동의 일부를 제공할 것 이다.
특정된 조직 내에서 세포 id의 완전 한 특성, 외 scRNA-Seq 데이터 집합에 대 한 가장 중요 한 분석 중 하나는 ‘정의’ 세포 인구에 걸쳐 중간 transcriptional 상태의 평가 이다. 이러한 중간 상태 전통적인 대량 RNA-Seq 접근 가능 했던 식별된 인구 내의 셀 간의 혈통 관계에 대 한 통찰력을가 르 친다 수 있습니다. 여러 scRNA-Seq bioinformatic 공구 지금이 명료 하 게 개발 되었습니다. 이러한 도구는, 예를 들어 암 세포 종양/전이성 상태로 전환 다양 한 터미널 운명 또는 상태와 무부하 상태 사이 왕복 하는 면역 세포로 성숙 하는 줄기 세포 관련 프로세스를 평가할 수 있습니다. 셀에 미묘한 transcriptome 차이 계보 편견, FateID, 같은 최근에 개발한 bioinformatic 도구47유추할 수 표시 될 수 있습니다. 이후 세포 전환 사이의 구분은 어려울 수 있습니다, 그리고 깊은 시퀀싱 필요한46수 transcriptional 차이 주어진 확인 미묘한 수 있습니다. 다행히, 다른 흐름 셀에 라이브러리를 다시 실행 하 여 데이터 집합을 추가 조사에 관심이 얕게 시퀀스 된 도서관의 범위를 늘릴 수 있습니다.
함께 찍은,이 프로토콜 transcriptionally 프로 한 실험에서 단일 세포의 수천 수백 사용자 수 있게 하는 적응 하기 쉬운 워크플로우를 제공 합니다. ScRNA-Seq 데이터 집합의 마지막 품질 최적화 된 세포 격리, cytometry, cDNA 라이브러리 생성 및 원시 유전자 바코드 매트릭스의 해석에 의존합니다. 이 위해,이 프로토콜에는 다양 한 조직 유형의 연구를 사용 하도록 쉽게 수정할 수 있는 모든 주요 단계에 대 한 포괄적인 개요를 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 캘거리 대학에서 동물 관리 시설 직원 뿐만 아니라 UCDNA 서비스 시설에서 지원 직원을 인정합니다. 우리는 그의 생물 정보학 지원에 대 한 매트 Workentine와 옌스 Durruthy 그의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 jb에 요, 및 친교 (대표)는 알버타 어린이 건강 연구 연구소 CIHR 새로운 탐정 수상 CIHR 그랜트 (R.M. 그리고 jb에 요)에 의해 자금.
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |