Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen für die Zubereitung von gesunder Erwachsenen einziger Säugerzellen Droplet-basierte, hohen Durchsatz Einzelzelle RNA-Seq Vorbereitungen notwendig. Sequenzierung Parameter, lesen Sie Ausrichtung und nachgelagerten einzellige bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.
Die Analyse der einzelnen Zelle Genexpression über Tausende von einzelnen Zellen innerhalb eines Gewebes oder einer Mikroumgebung ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung Zelle Komposition, Diskriminierung der Funktionszustände und molekulare Signalwege, die zugrunde liegenden beobachteten Gewebe Funktionen und tierische Verhaltensweisen. Die Isolation der intakten, gesunden einzelne Zellen von Erwachsenen Säugetier-Gewebe für spätere nachgelagerte Einzelzelle molekulare Analyse kann jedoch schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen, dass unbedingt erhalten Erwachsene Einzelzelle qualitativ hochwertige Präparate aus dem Nervensystem oder Haut, die anschließende unvoreingenommene Einzelzelle RNA Sequenzierung und Analyse aktiviert. Richtlinien für die nachgelagerten bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.
Mit der Entwicklung der hohen Durchsatz Einzelzelle Technologie1,2 und Fortschritte in der benutzerfreundlichen Bioinformatik über das letzte Jahrzehnt3entstand ein neues Feld der hochauflösenden Ausdruck Genanalyse – einzelne Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq). Das Studium der einzelnen Zelle Genexpression wurde ursprünglich entwickelt, um Heterogenität innerhalb definierter Zellpopulationen, wie z. B. in Stammzellen und Krebszellen, zu identifizieren oder um seltene Populationen von Zellen4,5, zu identifizieren, die unerreichbar waren traditionelle Masse RNA Sequenzierung Techniken. Bioinformatische Werkzeuge ermöglichten die Identifizierung von neuen Sub-Populationen (Seurat)2, Visualisierung des Ordens Zellen entlang einer Psuedotime Raum (Monokel)6, Definition der aktive Signalisierung Netzwerke innerhalb oder zwischen Populationen ( MALERISCHE)7, Vorhersage der Versammlung der einzelnen Zellen in eine künstliche 3D-Raum (Seurat und vieles mehr)8. Diese neue und spannende Analysen der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung ScRNA-Seq schnell-die neue Standardtherapie für Genanalyse Ausdruck gewinnt.
Trotz des großen Potenzials des ScRNA-Seq kann die technischen Fachkenntnisse erforderlich, um eine saubere Dataset zu produzieren und präzise Ergebnisse interpretieren die Neuankömmlinge herausfordernd sein. Hier ist eine einfache, aber umfassende Protokoll, ausgehend von der Isolation einzelner Zellen aus dem gesamten primären Gewebe zur Visualisierung und Präsentation von Daten für die Veröffentlichung (Abbildung 1) präsentiert. Erstens kann die Isolierung der einzelnen Krebszellen anspruchsvoll, als verschiedene Gewebe in ihrem Grad der Empfindlichkeit gegenüber enzymatischen Verdauung und anschließende mechanische Dissoziation variieren. Dieses Protokoll enthält Anleitungen in den folgenden Schritten isoliert und identifiziert wichtige Qualitätskontrolle Checkpoints während des Prozesses. Zweitens kann es verwirrend sein, Verständnis für die Kompatibilität und Anforderungen zwischen einzelnen Zellentechnologie und Sequenzierung der nächsten Generation. Dieses Protokoll enthält Richtlinien zur Umsetzung einer benutzerfreundliche, Tropfen-basierte einzellige Barcoding-Plattform und Sequenzierung durchführen. Computer-Programmierung ist schließlich eine wichtige Voraussetzung für die Analyse von einzelligen transkriptomischen Datensätze. Dieses Protokoll stellt Ressourcen für erste Schritte mit der Programmiersprache R und Anleitungen für die Umsetzung der beiden beliebten ScRNA-Seq-spezifische R-Pakete. Dieses Protokoll kann zusammen, Newcomer im ScRNA-Seq-Analyse für klare, interpretierbare Ergebnisse führen. Dieses Protokoll kann auf den meisten Geweben in der Maus eingestellt werden und vor allem für die Verwendung mit anderen Organismen, einschließlich menschliches Gewebe geändert werden könnte. Anpassungen je nach Gewebe und Benutzer werden benötigt.
Es gibt mehrere Überlegungen im Auge zu behalten, während im Anschluss an dieses Protokolls; darunter 1) im Anschluss an alle Richtlinien der Qualitätskontrolle in der Schritte 1 und 2 dieses Protokolls wird empfohlen, eine tragfähige Einzelzelle Aussetzung aller Zellen in der Probe von Interesse zu gewährleisten und gleichzeitig präzise Ergebniszelle zählt (zusammengefasst in Abbildung 2 ). Sobald dies erreicht ist, und wenn die optimierte Bedingungen befolgt werden, die Qualitätskontrolle Schritte fallen gelassen werden können (zu sparen Zeit – Erhaltung RNA Qualität und Reduzierung der Zell-Verlust). Bestätigung erfolgreich isoliert hohe Rentabilität einzelner Zellen aus dem Gewebe von Interesse ist hoch empfehlen vor allen nachgelagerten Verarbeitung. (2) da einige Zelltypen empfindlicher als andere sind zu betonen, können übermäßige Dissoziation Techniken versehentlich die Bevölkerung daher Störfaktoren nachgelagerte Analyse beeinflussen. Sanfte Dissoziation ohne unnötige zellulären Scheren und Verdauung ist entscheidend für die zelluläre ertragreich und eine genaue Darstellung der Zusammensetzung des Gewebes zu erreichen. Scherkräfte auftreten, während der Verreibung, FACS und Wiederfreisetzung Schritte. (3) als mit RNA arbeiten, ist es am besten als kleine zusätzliche RNase in die Probe möglichst während der Zubereitung einzuführen. Dies wird helfen, qualitativ hochwertige RNA zu pflegen. Ribonuklease Inhibitor Lösungen mit Spülung, saubere Werkzeuge und Geräte, die nicht verwenden RNase-freie, aber vermeiden Sie DEPC-behandeltem Produkte. (4) durchführen Sie die Vorbereitungen so schnell wie möglich. Damit erhalten Sie qualitativ hochwertige RNA und Zelltod zu reduzieren. Je nach Gewebe Dissektion Länge und Tier eine solche Gruppe Gründen mehrere Sektionen/Vorbereitungen zur gleichen Zeit. (5) bereiten Sie Zellen auf Eis vor, wenn möglich zu pflegen hochwertige RNA, Zelltod reduzieren und langsam Zelle Signalisierung und transkriptionelle Aktivität. Wenn auch eiskalte Verarbeitung ideal für die meisten Zelltypen ist, Leistung einige Zelltypen (z.B. Neutrophile) bessere bei der Verarbeitung bei Raumtemperatur. (6) vermeiden Sie Calcium, Magnesium, EDTA und DEPC-behandeltem Produkte während der Vorbereitung der Zelle.
Dieses Protokoll zeigt, wie die angemessene Vorbereitung einzelner Zellen entdecken die transkriptionelle Heterogenität aus Tausenden von einzelnen Zellen und Funktionszustände oder einzigartige zelluläre Identitäten innerhalb eines Gewebes zu unterscheiden kann. Das Protokoll erfordert keine Reporter fluoreszierende Proteine oder transgenen Werkzeuge und kann auch auf die Isolierung einzelner Zellen aus verschiedenen Geweben von Interesse, die auch von Menschen; unter Berücksichtigung jedes Gewebe ist einzigartig und dieses Protokoll erfordert ein gewisses Maß an Anpassung/Änderung.
Die vielfältigen und höchst dynamischen transkriptionelle Programme innerhalb von Zellen betonten den Wert der einzelligen Genomics. Neben qualitativ hochwertigen RNA zu isolieren, ist eine kritische Probe Vorbereitungsschritt für qualitativ hochwertige Datensätze notwendig sicherzustellen, dass Zellen vollständig aus Gewebe freigesetzt werden und Zellen gesund und intakt sind. Dies ist relativ geradlinig für Sammeln von Zellen, die leicht sind veröffentlichte z. B. zirkulierenden Zellen oder Geweben, wo Lose Zellen beibehalten werden, z. B. in lymphatischen Geweben. Dies kann jedoch eine Herausforderung für andere adulten Geweben aufgrund der hoch entwickelten zellulären Architektur über große Entfernungen, umgebenden extrazellulären Matrix und die oft starren Zellskelett Proteine, die bei der Aufrechterhaltung der Zellstruktur. Auch mit entsprechenden Dissoziation Techniken für die Vollversion von Zellen gibt es Potenzial, dass die strenge und oft langwierige Verarbeitung erforderlich mRNA Qualität und Zelle Integrität verändern würde. Darüber hinaus wirken sich die hohen Temperaturen verwendet für Enzym-gestützte Dissoziation auch transkriptionelle Signaturen29,30. Die Absicht des Protokolls ist vorzulegen Qualitätskontrolle prüft mit Geweben wie Markhaltige Erwachsenen Nerven und der extrazellulären Matrix-reiche Erwachsene Haut, um zu demonstrieren wie Optimierung kann helfen, um diese Hindernisse zu überwinden.
Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung jedes ScRNA-Seq-Experiment ist die Wahl der Sequenzierung Tiefe. Sequenzierung hoch gemultiplext und gelesen werden kann Tiefe kann variieren von sehr niedrigen mit Drop-Seq2 auf bis zu 5 Millionen Mal gelesen/Zelle14 mit einer Full-length RNA-Seq-Methode wie Smart-seq. Die meisten ScRNA-Seq Experimente erkennt mäßigen bis hohen Ausdruck Protokolle mit Sequenzierung so niedrig wie 10.000 mal gelesen/Zelle, was für Zelle Art Klassifikation41,42in der Regel ausreichend ist. Flache Sequenzierung Tiefe ist der Wert bei Sequenzierung Kosten sparen, wenn Sie versuchen, seltene Zellpopulationen über komplexe Gewebe erkennen, wo Tausende von Zellen erforderlich ist, um selbstbewusst seltenere Populationen zuschreiben. Aber geringer Tiefe Sequenzierung ist nicht ausreichend, wenn detaillierte Informationen über Genexpression und Prozesse im Zusammenhang mit subtilen transkriptionelle Unterschriften notwendig ist. Derzeit wird geschätzt, dass die große Mehrheit der Gene in einer Zelle mit 500.000 mal gelesen/Zelle, erkannt werden, aber dies je nach Protokoll variieren kann und Gewebe Typ43,44. Während in voller Länge Abschrift Sequenzierung die Notwendigkeit für die Montage umgeht und daher, Roman oder seltene Splice-Varianten erkennen kann, begrenzt Sequenzierung Kosten oft Skalierung solche Ansätze um Tausende von Zellen bestehend aus einem komplexe Gewebe-System zu untersuchen. Im Gegensatz dazu getaggt 3′ einzellige Bibliotheken wie beschrieben in diesem Protokoll in der Regel geringeren Komplexität haben und flacheren Sequenzierung erforderlich. Es ist wichtig zu beachten, dass Bibliotheken generiert mit dem beschriebenen Protokoll auf einem der fünf unterstützten Sequenzer sequenziert werden können: (1) NovaSeq, (2) Leseweite 3000/4000 (3) Leseweite 2500 schnellen Lauf und hohe Leistung, (4) NextSeq 500/550 und (5) MiSeq.
Ein alternativer Ansatz zur einzelnen Zelle RNA-Seq, der reduziert die Notwendigkeit für empfindliche Gewebe und Zellen, die Handhabung noch einige der Vorteile der einzelnen Zelle RNA-Seq unterhält, ist die Analyse der RNA aus einzelnen Kernen45. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnellere Verarbeitung Verringerung der RNA-Abbau und mehr extreme Maßnahmen zur Gewährleistung der angemessenen Veröffentlichung von Kernen und somit wahrscheinlich ein selbstbewusster Erfassung der transcriptional Profile repräsentieren alle Zellen in einem bestimmten Gewebe ermöglicht. Dies würde, natürlich, bieten nur einen Teil der transkriptionelle Aktivität in einer bestimmten Zelle, also je nach was experimentelle Ziele von Interesse sind, dieser Ansatz möglicherweise oder möglicherweise nicht geeignet.
Neben der vollständigen Charakterisierung der zellulären Identitäten innerhalb eines bestimmten Gewebes ist eines der wertvollsten Analysen für ScRNA-Seq-Datasets die Beurteilung der transkriptionellen Zwischenzustände in “definierten” Zell-Populationen. Diese vermittelnden Staaten können vermitteln Einblicke in die Linie Beziehungen zwischen Zellen in bestimmten Bevölkerungsgruppen, die nicht mit traditionellen Masse möglich war, die RNA-Seq nähert. Mehrere ScRNA-Seq bioinformatische Werkzeuge wurden jetzt entwickelt, um dies aufzuklären. Solche Tools können die Prozesse beteiligt, zum Beispiel Krebszellen Übergang zu einem onkogenen/metastasierten Zustand, Stammzellen, die Reifen zu vielfältigen terminal Schicksale oder Immunzellen pendelt zwischen aktiven und ruhenden Zustand beurteilen. Subtile Transkriptom Unterschiede in den Zellen möglicherweise auch bezeichnend für Linie Vorurteile, dass neu entwickelte Bioinformatic Hilfsmittel wie FateID,47ableiten können. Da die Unterschiede zwischen den Zellen den Übergang schwierig sein können angesichts der transkriptionellen Unterschiede feststellen kann subtil sein, tiefer Sequenzierung möglicherweise notwendigen46. Glücklicherweise werden Abdeckung einer flach sequenzierten Bibliothek erhöht, wenn das Dataset weiter durch erneutes Ausführen der Bibliothek auf einem anderen Durchflusszelle Sondieren Sie interessieren.
Zusammen genommen, bietet dieses Protokoll einen leicht anzupassen Workflow, der Benutzern ermöglicht, Hunderte bis Tausende von Einzel-Zellen innerhalb eines Experiments transcriptionally Profil. Die endgültige Qualität eines ScRNA-Seq-Datasets stützt sich auf optimierte Zelle Isolation, Durchflusszytometrie, cDNA Bibliothek Generierung und Interpretation der Roh-gen-Barcode-Matrizen. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll einen umfassenden Überblick über alle wichtigen Schritte, die leicht geändert werden können, um Studien von verschiedenen Gewebearten zu ermöglichen.
The authors have nothing to disclose.
Wir anerkennen die Support-Mitarbeiter in der UCDNA-Dienstleistungen-Anlage sowie die Animal Care Mitarbeiter der Einrichtung an der University of Calgary. Wir danken Matt Workentine für seine Unterstützung der Bioinformatik und Jens Durruthy für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziert durch einen CIHR Zuschuss (r.m. und j.b.), ein CIHR neue Investigator Award, j.b. und eine Alberta Kinder Health Research Institute Fellowship (j.s.).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |