Ce protocole décrit les processus générales et contrôle qualité vérifie nécessaire pour la préparation de cellules unique chez les mammifères adultes saines pour les préparations de RNA-Seq cellule unique axée sur la gouttelette, haut débit. Séquençage des paramètres, l’alignement de lecture et l’analyse bioinformatique de cellule unique en aval sont également fournis.
L’analyse de l’expression génique cellulaire unique sur des milliers de différentes cellules dans un tissu ou un micro-environnement est un outil précieux pour identifier la composition cellulaire, la discrimination des États fonctionnels et les voies moléculaires qui sous-tendent les tissus observés fonctions et les comportements animaux. Toutefois, l’isolement des monocellules intacts, sains provenant de tissus de mammifères adultes pour l’analyse moléculaire ultérieures unicellulaire en aval peut être difficile. Ce protocole décrit les processus générales et contrôle qualité vérifie nécessaires pour obtenir des préparations de qualité adult unicellulaire du système nerveux ou de la peau qui activé l’analyse et le séquençage d’ultérieures unicellulaire impartiale RNA. Lignes directrices pour l’analyse bioinformatique en aval sont également fournis.
Avec le développement du haut débit unicellulaire technologie1,2 et les avancements dans les outils de bio-informatique conviviale au cours de la dernière décennie3, un nouveau champ d’analyse de l’expression génique à haute résolution est apparu – séquençage de RNA unicellulaires (scRNA-Seq). L’étude de l’expression génique cellulaire unique est d’abord développée pour identifier l’hétérogénéité au sein de populations de cellules définis, tels que dans les cellules souches ou cellules cancéreuses, ou pour identifier les rares populations de cellules4,5, qui étaient inaccessibles à l’aide techniques de séquençage de RNA traditionnelles en vrac. Outils bioinformatiques ont permis l’identification de nouveaux sous-groupes (Seurat)2, visualisation de l’ordre de cellules le long d’un psuedotime espace (Monocle)6, définition des réseaux de signalisation actifs au sein ou entre populations ( SCENIC)7, prédiction de l’Assemblée de cellules unique dans un espace 3D artificiel (Seurat, etc.)8. Avec ces analyses nouvelles et passionnantes dont dispose la communauté scientifique, scRNA-Seq rapide-devient la nouvelle approche standard pour l’analyse de l’expression génique.
Malgré l’énorme potentiel de scRNA-Seq, les niveaux de compétences techniques nécessaire pour produire un ensemble de données propre à interpréter correctement les résultats peut être difficile aux nouveaux arrivants. Ici, un protocole de base, mais complet, à partir de l’isolement des cellules individuelles de tissus ensemble primaires à la visualisation et la présentation des données pour publication est présenté (Figure 1). Tout d’abord, l’isolement de cellules individuelles en bonne santé peut être réputé difficile, puisque les différents tissus varient dans leur degré de sensibilité à la digestion enzymatique et dissociation mécanique ultérieure. Ce protocole donne des indications à ces mesures d’isolement et identifie les points de contrôle importants de contrôle de qualité tout au long du processus. En second lieu, il peut être déroutant de comprendre la compatibilité et les exigences entre la technologie de cellule unique et séquençage de prochaine génération. Ce protocole fournit des directives pour mettre en œuvre une plate-forme conviviale, axée sur les gouttelettes barcoding unicellulaires et effectuez le séquençage. Enfin, la programmation informatique est une condition préalable importante pour l’analyse des ensembles de données transcriptomiques unicellulaires. Ce protocole fournit des ressources pour débuter avec le langage de programmation R et fournit des conseils sur la mise en œuvre de deux paquets de R scRNA-Seq-specific populaires. Ensemble, ce protocole peut guider les nouveaux arrivants en analyse scRNA-Seq pour obtenir des résultats clairs et interprétables. Ce protocole peut être ajusté à la plupart des tissus chez la souris et ce qui est important, pourrait être modifié pour être utilisé avec d’autres organismes, y compris les tissus humains. Ajustements selon le tissu et l’utilisateur sera nécessaires.
Il y a plusieurs considérations à garder à l’esprit tout en suivant ce protocole ; y compris, 1) à la suite toutes les directives de contrôle de la qualité aux étapes 1 et 2 du présent protocole est recommandée pour assurer une suspension monocellulaire viable de toutes les cellules de l’échantillon d’intérêt tout en assurant la précision totale numéros globules (résumées dans Figure 2 ). Une fois que cela est possible, et si toutes les conditions optimisées sont suivies, les mesures de contrôle de la qualité peuvent être déposés (pour gagner du temps – préserver la qualité de RNA réduisant cellulaires et perte). Confirmant la réussite de l’isolement de cellules uniques de grande viabilité des tissus d’intérêt est hautement recommander avant tout en aval de traitement. 2) étant donné que certains types de cellules sont plus sensibles que d’autres au stress, techniques de dissociation excessive peuvent biaiser par inadvertance de la population, donc confusion analyse en aval. Dissociation douce sans cisaillement cellulaires inutiles et la digestion est essentielle pour atteindre des rendements élevés de cellulaires et une représentation exacte de la composition du tissu. Forces de cisaillement se produisent au cours des étapes de trituration, FACS et la remise en suspension. 3) comme avec n’importe quel travail d’ARN, est-il préférable d’introduire comme peu RNase supplémentaire dans l’échantillon que possible au cours de la préparation. Cela aidera à maintenir la qualité RNA. Utiliser des solutions d’inhibiteur de la ribonucléase avec rinçage à nettoyer l’outillage et tout matériel qui n’est pas exempte de RNase mais éviter les produits traités DEPC. 4) effectuer des préparations aussi rapidement que possible. Cela aidera à maintenir la qualité RNA et réduire la mort cellulaire. Selon la longueur de la dissection des tissus et plusieurs animaux, considère la création de multiples dissections/préparations en même temps. 5) préparer les cellules sur la glace si possible de maintenir la haute qualité RNA, réduire la mort cellulaire et ralentir l’activité transcriptionnelle et de signalisation de cellules. Quoique, traitement glacée est idéal pour la plupart des types de cellules, certains types de cellules (par exemple, neutrophiles) performants lors du traitement à température ambiante. 6) éviter le calcium, magnésium, EDTA et les produits traités DEPC au cours de la préparation de cellules.
Ce protocole montre comment la préparation adéquate des cellules simples peut découvrir l’hétérogénéité transcriptionnelle de milliers de cellules individuelles et discriminer les États fonctionnels ou identités cellulaires uniques au sein d’un tissu. Le protocole n’exige pas de protéines fluorescentes journaliste ou outils transgéniques et peut être appliqué à l’isolement de cellules isolées de divers tissus d’intérêt, y compris ceux de l’homme ; gardant à l’esprit de chaque tissu est unique et ce protocole exigera une certaine adaptation ou la modification.
Les programmes de transcriptional diversifiés et très dynamiques au sein de cellules ont souligné la valeur de la cellule unique génomique. En dehors d’isoler l’ARN de haute qualité, une étape de préparation d’échantillon critique nécessaire pour les ensembles de données de haute qualité est de s’assurer que les cellules sont complètement libérés du tissu et que les cellules sont sains et intacts. C’est relativement simple pour prélever des cellules qui sont facilement mises, comme les cellules circulantes ou dans les tissus où les cellules sont plus ou moins conservés, comme dans les tissus lymphoïdes. Mais cela peut être difficile pour les autres tissus adultes, en raison de l’architecture cellulaire hautement développée, s’étendant sur grandes distances, entourant la matrice extracellulaire et les protéines du cytosquelette souvent rigides impliqués dans le maintien de la structure cellulaire. Même avec des techniques de dissociation appropriées pour la libération totale des cellules, il est possible que le traitement souvent long et rigoureux nécessaire modifierait intégrité de qualité et de la cellule de mRNA. En outre, les hautes températures utilisées pour la dissociation assistée par enzyme affectent également la transcription signatures29,30. Le but du protocole est de présenter le contrôle de la qualité vérifie, à l’aide de tissus tels que le nerf adult myélinisée et la peau adulte riches en matrice extracellulaire pour démontrer comment l’optimisation peut aider à surmonter ces obstacles.
Une considération importante lors de la conception de toute expérience de scRNA-Seq est le choix de la profondeur de séquençage. Séquençage peut être hautement multiplexé et lu profondeur peut varier d’une très faible à l’aide de Drop-Seq2 et jusqu’à 5 millions de lectures/cellule14 en utilisant une méthode de RNA-Seq longue tels que Smart-suiv. Plupart des expériences de scRNA-Seq peuvent détecter des transcriptions de modérée à forte expression avec le séquençage aussi bas que 10 000 lectures/cellule, qui est généralement suffisant pour cellule type classification41,,42. Profondeur de séquençage peu profonde est précieux pour économiser sur les coûts de séquençage en essayant de détecter des populations cellulaires rares à travers les tissus complexes où des milliers de cellules peuvent être nécessaire d’attribuer avec certitude les populations rares. Mais le séquençage de faible profondeur n’est pas suffisant lorsque des informations détaillées sur l’expression des gènes et des processus associées aux signatures de transcriptionnelles subtiles sont nécessaires. Actuellement, on estime que la grande majorité des gènes dans une cellule est détectée avec 500 000 lectures/cellule, mais cela peut varier selon le protocole et le tissu type43,44. Tandis que la transcription du séquençage contourne la nécessité pour l’Assemblée et peut, par conséquent, détecter roman ou épissure rares variantes, coûts de séquençage limitent souvent mise à l’échelle de telles approches afin d’examiner des milliers de cellules comprenant un système complexe de tissus. En revanche, 3′ tag libraries unicellulaires tels que ceux décrits dans le présent protocole en général ont plus faible complexité et requièrent moins profond séquencement. Il est important de noter que bibliothèques générés à l’aide du protocole décrit peuvent être séquencés sur l’un des cinq séquenceurs supportés : 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 course rapide et High Output, 4) NextSeq 500/550 et MiSeq 5).
Une approche alternative à cellule unique RNA-Seq, qui réduit la nécessité pour les tissus délicats et cellule gère encore conserve certains des avantages d’une seule cellule RNA-Seq, est l’analyse de l’ARN de noyaux unique45. Cette approche permet un traitement plus rapid, réduire la dégradation de l’ARN et plus des mesures extrêmes pour assurer une diffusion adéquate des noyaux et donc probablement permet une capture plus confiante des profils transcriptionnels qui représente toutes les cellules dans un tissu donné. Ceci, bien sûr, seulement fournirait une partie de l’activité transcriptionnelle présente dans une cellule donnée, donc selon quels objectifs expérimentaux sont d’intérêt de cette approche peut ou peut ne pas convenir.
Sans compter que la caractérisation complète des identités cellulaires au sein d’un tissu donné, une des analyses plus précieux pour les ensembles de données scRNA-Seq est l’évaluation des États intermédiaires de transcriptional parmi les populations cellulaires « définie ». Ces États intermédiaires peuvent donner un aperçu des relations de lignée entre cellules au sein de populations identifiées, ce qui n’était pas possible avec la traditionnelle en vrac que RNA-Seq s’approche. Plusieurs outils bioinformatiques de scRNA-Seq ont maintenant été développés afin d’élucider ce. Ces outils peuvent évaluer les processus impliqués dans, par exemple, les cellules cancéreuses la transition vers un état oncogènes ou métastatique, venant à échéance dans divers destins terminales ou navette entre États quiescentes et actives les cellules immunitaires des cellules souches. Transcriptome de subtiles différences dans les cellules peuvent également être indicatives des biais de lignage, bioinformatique récemment mis au point des outils tels que FateID, peut déduire47. Étant donné que les distinctions entre les cellules de transition peuvent être difficiles à déterminer compte tenu des différences de transcriptionnelles peut être subtile, séquençage plus profond peut être nécessaire de46. Heureusement, la couverture d’une bibliothèque très superficiellement séquencée peut être augmentée si vous êtes intéressé dans la détection de l’ensemble de données plus loin en exécutant à nouveau la bibliothèque sur une autre cellule de flux.
Globalement, ce protocole prévoit un flux de travail facile-à-adaptation qui permet aux utilisateurs de profil transcriptionnellement des centaines de milliers de cellules au sein d’une expérience unique. La qualité finale d’un dataset scRNA-Seq repose sur l’isolement cellulaire optimisée, la cytométrie en flux, cDNA bibliothèque génération et interprétation des matrices de gène-code à barres brutes. À cette fin, le présent protocole donne un aperçu détaillé de toutes les étapes clés qui peuvent être facilement modifiées pour permettre des études de types de tissus différents.
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons que le personnel de soutien à l’installation de Services de UCDNA, ainsi que le personnel de l’établissement animalier à l’Université de Calgary. Nous remercions Matt Workentine pour son soutien de bio-informatique et Jens Durruthy pour son soutien technique. Ce travail a été financé par une subvention des IRSC (R.M. et J.B.), une bourse de nouveau chercheur des IRSC à J.B. et l’Alberta Children Health Research Institute Fellowship (J.S.).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |