Summary

Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse

Published: January 16, 2019
doi:

Summary

Wir beschrieben hier, ein High-Content bildgebendes Verfahren zur Quantifizierung des Transports von Rhodopsin Mutanten mit Retinitis Pigmentosa verbunden. Eine Multiple-Wellenlänge scoring Analyse wurde zur Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche oder in der ganzen Zelle zu quantifizieren.

Abstract

Rhodopsin Fehlfaltung Mutationen führen zum Stab Photorezeptor Tod, die manifestiert als autosomal dominante Retinopathia Pigmentosa (RP), eine Progressive Verblindung Krankheit, die wirksame Behandlung fehlt. Wir vermuten, dass die Zytotoxizität des mutierten fehlgefaltete Rhodopsin gelindert werden kann, indem Sie pharmakologisch stabilisieren das mutierte Rhodopsin-Protein. P23H Mutation, unter die andere Klasse II Rhodopsin Mutationen, kodiert ein strukturell instabil Rhodopsin mutierte Protein, das in das endoplasmatische Retikulum (ER), akkumuliert wird, während das Wildtyp Rhodopsin in der Plasmamembran in Säugetieren transportiert wird Zellen. Wir zuvor eine Lumineszenz-basierte Hochdurchsatz-Screen (HTS) durchgeführt und identifiziert eine Gruppe von pharmakologischen Chaperonen, die den Transport von das P23H Rhodopsin aus ER auf die Plasmamembran gerettet. Hier quantifiziert ein Immunostaining Methode, gefolgt von einer hohen bildgebenden Inhaltsanalyse, wir den mutierten Rhodopsin Protein Betrag in die ganze Zelle und auf die Plasmamembran. Diese Methode ist informativ und effektiv, um wahre Hits aus Fehlalarme nach HTS identifizieren Die High-Content Bildanalyse ermöglichte darüber hinaus mehrere Parameter aus einem einzigen Experiment auszuwertende die pharmakologischen Eigenschaften von jeder Verbindung zu quantifizieren. Mit Hilfe dieser Assay, analysierten wir die Wirkung von 11 verschiedenen Verbindungen in Richtung sechs RP verbundenen Rhodopsin Mutanten, erhalten ein 2-D pharmakologischen Profil für eine quantitative und qualitative Verständnis über die strukturelle Stabilität dieser Rhodopsin-Mutanten und Wirksamkeit verschiedener Verbindungen in Richtung dieser Mutanten.

Introduction

Protein misfolding ist Muskeldystrophie sowie neuronale Degenerationen und blendende Krankheiten, einschließlich Retinitis Pigmentosa (RP)1beteiligt. RP ist eine vererbte und progressive Degeneration der Netzhaut Mutationen in mehr als 60 Gene beeinflussen die Funktion und die Homöostase des Stabes Photorezeptoren oder die Netzhaut pigmentiert Epithele (RPEs)2,3zugeordnet. Keine wirksame Behandlung gibt es derzeit für RP. Rhodopsin Mutationen entfallen etwa 25-30 % der autosomal-Dominant (n. Chr.) RP-Fällen. Unter den mehr als 150 Rhodopsin Mutationen4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), die Klasse II-Mutationen verursachen die strukturelle Instabilität des Proteins Rhodopsin, die zum Stab Photorezeptor Tod beiträgt und Vision Verlust5,6,7,8. Die P23H ist die häufigste Rhodopsin -Mutation in Nordamerika, die auch ein typisches Beispiel für die Klasse II Rhodopsin Mutationen9,10. Aufgrund seiner inhärenten strukturelle Instabilität ist das fehlgefaltete Rhodopsin in das endoplasmatische Retikulum (ER) in Säugerzellen, angesammelt, während der Wildtyp Rhodopsin auf der Plasmamembran5befindet. Das fehlgefaltete Rhodopsin P23H mutierte Exponate dominant negativen Zytotoxizität, die nicht aufgrund von Haploinsufficiency, sondern bezieht sich auf die Aktivierung der ER Protein Degradation Weg und der unterbrochenen Stab äußere Segment Organisation verbunden. Um die Rute Photorezeptor Zelle Stress zu lindern, ist eine Strategie zur Stabilisierung der native Faltung der mutierten Rhodopsin mit pharmakologische Chaperon.

Um dieses Ziel zu erreichen, führten wir eine zellbasierten Hochdurchsatz-Screen (Cloggings)11,12,13 mit einem β-Galaktosidase Fragment Komplementierung Assay, das P23H Rhodopsin mutierte transportiert auf dem Plasma zu quantifizieren Membran. Die robuste und einfache Protokoll des HTS Assays konnten wir die Aktivitäten der rund 79.000 kleine Moleküle für jeden Bildschirm zu erkunden. Weil dieser HTS Assay Lumineszenz Signale liest, sind falsch positive Ergebnisse, einschließlich der β-gal-Hemmer jedoch farbige oder zytotoxische Substanzen in der Trefferliste, die darauf warten, von einem sekundären Assay identifiziert werden enthalten.

Die traditionelle Immunostaining und Fluoreszenz bildgebenden Verfahren wurden jahrelang zur Studie des Rhodopsin-Transports in Säugerzellen5,14,15,16. Jedoch können nicht diese konventionellen Methoden verwendet werden, um die pharmakologische Wirkungen von mehr als 10 Verbindungen in Richtung Rhodopsin Verkehr zu quantifizieren, da eine zuverlässige bildgebende Analyse erfordert eine große Anzahl von Aufnahmen unter einer sehr konsistent Bedingung, die von der konventionellen bildgebenden Verfahren nicht geändert. Hier entwickelten wir eine Immunostaining basierten High-Content imaging Protokoll als eine sekundäre Assay, der Cell Landverkehre fehlgefaltete Rhodopsin Mutanten11,13,17zu quantifizieren. Rhodopsin auf der Plasmamembran beschriften, wir dem Schritt übersprungen Permeabilisierung der Zellmembran und Immunostained die Rhodopsin-Mutanten durch einen monoklonalen (B6-30) Anti-Rhodopsin erkennen die N-terminale Epitop des Rhodopsin auf der extrazellulären Seite der Zelle Membran-18. Um das mutierte Rhodopsin in der ganzen Zelle zu visualisieren, verschmolzen wir Rhodopsin mit dem Venus-Fluoreszenz-Protein. Durch die Quantifizierung der Fluoreszenz-Intensitäten in verschiedenen Fluoreszenz Kanälen sind wir in der Lage, mehrere Parameter von einem einzigen Experiment einschließlich der gesamten Rhodopsin-Intensität in der ganzen Zelle auf der Zelloberfläche und das Verhältnis von zu erhalten Rhodopsin Fluoreszenz auf der Zelloberfläche, die in der ganzen Zelle. Anwendung dieser Methode zu stabilen Zellen insgesamt sechs fehlgefaltete Rhodopsin durch Mutation entstehende Variationen zum Ausdruck zu bringen, können wir eine pharmakologische Profil der mehrere kleine Molekül Chaperone gegenüber diesen Mutanten erzeugen. In diesem Protokoll alle Zellen sind Immunostained in einem 384-Well-Platte und abgebildet, mit einem automatisierten imaging System unter einer sehr konsistent bildgebenden Bedingung. Eine Bildanalyse erfolgt in jede Vertiefung, mit Bildern von mehr als 600 Zellen Variante aufgrund der Heterogenität der Zellen mit unterschiedlichen Zellebene Form und Protein-Expression zu reduzieren. Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1zusammengefasst. Der Vorteil dieser Methode ist, dass wir hochauflösende Bilder sowie Multi-Parameter-Quantifizierungen aus der Image-basierte Analyse erhalten. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll geändert und angewendet, um den Transport fehlgefaltete Membran Proteins des Interesses zu quantifizieren.

Protocol

Hinweis: Das Rhodopsin Transport Assay. 1. Vorbereitung und die Kultur der Zellen Wiederzubeleben Sie Cryo-erhalten U2OS stabile Zellen mit dem Ausdruck der Wildtyp (WT) oder mutierte Maus Rhodopsin-Venus Fusionsproteine. Auftauen der Zellen bei 37 ° C, bis nur kleine Eiskristalle in der Flasche übrig sind.Hinweis: Die U2OS Zellen sind in diesem Protokoll verwendet, da gibt es keine Photorezeptor-Zell-Linie für in-vitro- Studien und die Pre-ciliary Bi…

Representative Results

Wir zeichnen die Rhodopsin-Transport mit drei Parameter: die Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (Rhodopsin-Venus INT), die Immunostaining Intensität des Rhodopsin auf der Plasmamembran (Rhodopsin INT auf der Zelloberfläche) und das Verhältnis von Rhodopsin Fleck auf der Zelloberfläche Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (MEM-Total-Ratio). Ein repräsentatives Ergebnis des Rhodopsin-Transport-Assays ist in Abbildung 3 und <strong c…

Discussion

Hier zeigten wir einen High-Content imaging Assay verwendet für die Charakterisierung von Hits aus einem HTS identifiziert Die einzige Automatisierung dieser Protokolle beteiligt ist der High-Content-Imager. Die Immunostaining und Fluoreszenz-Bildgebung des Rhodopsin haben häufig verwendet, um die Lokalisierung von Rhodopsin5,14,15,16zu charakterisieren. Allerdings ist die Quantifizierung der…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei Dr. Mark E. Schurdak und University of Pittsburgh Drug Discovery Institute für die Bereitstellung von High-Content Imager und erste Schulungen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) teilten großzügig 1-4 und B630 Anti-Rhodopsin Antikörper. Das Plasmid enthält die cDNA Maus Rhodopsin-Venus Konstrukt wurde von Dr. Nevin Lambert (Augusta Universität) geteilt. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant EY024992 YC und P30EY008098 von der University of Pittsburgh Vision Forschung Core Grant unterstützt.

Materials

U2OS (rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
DMEM high glucose Genesee Scientific 25-500 With L-Glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16140071 Heat inactivated
Plasmocin InvivoGen ant-mpt Mycoplasma elimination reagent
Penicillin-Streptomycin (100X) Gibco 15140122 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures
Trypsin-EDTA Genesee Scientific 25-510 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium
Poly-L-lysine solution Sigma-Aldrich P4707-50ML Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
CellCarrier-384 Ultra Microplates PerkinElmer 6057300 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis
Sterile 96-well plate Eppendorf 30730119 Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic
Phosphate Buffered Sailine (PBS) Invitrogen AM9625 10 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSO Sigma-Aldrich D4540 >99.5%, cell culture tested
9-cis-retinal Sigma-Aldrich R5754
Compounds tested Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized NA Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized
B6-30 anti-rhodopsin antibody Novus NBP2-25160 Gift from Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 115-165-146
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Methanol-free
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 50062Z Blocking buffer
Hoechst 33342, Trihydroch Invitrogen H3570 Nuclear staining solution
High-content imager Molecular Devices ImageXpress ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress high-content image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress High-content image acquisition and analysis software
Multichannel pipette (0.5-10 µL) Rainin 17013802 Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL
Multichannel pipette (0.5-10c Rainin 17013805 Manual 8-channel pipette, 20-200 µL
Electronic multichannel pipette (10-200 μL) Thermo Scientific 14-3879-56BT Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks
50ml Reagent Reservoir Genesee Scientific 28-125 Reagent reservior for multichannel pippte dispensing
8-Channel aspirator ABC Scientific EV503 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates
Excel spreadsheet software Microsoft Excel2016 The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation
Origin2018 scientific data analysis and graphing software OriginLab Origin2018 The data analysis software for generating the dose response curves

References

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Cite This Article
Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58703, doi:10.3791/58703 (2019).

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