Summary

Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur

Published: January 16, 2019
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Summary

Ici, nous avons décrit une méthode d’imagerie de haute teneur pour quantifier le transport des mutants de rhodopsine associée à une rétinite pigmentaire. Une analyse de notation d’onde multiples a été utilisée pour quantifier la protéine rhodopsin sur la surface de la cellule ou dans la cellule entière.

Abstract

Des mutations de rhodopsine pourrait conduisent à la mort de photorécepteur de tige qui se manifeste comme autosomique dominante rétinite pigmentaire (RP), un progressif aveuglante de maladie qui n’a pas de traitement efficace. Nous émettons l’hypothèse que la cytotoxicité du mutant rhodopsine mal repliées peut être atténuée en stabilisant pharmacologiquement la protéine mutante rhodopsine. La mutation de P23H, parmi les autres mutations de rhodopsine de classe II, code pour une protéine mutante rhodopsine structurellement instable qui s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re), alors que la rhodopsine de type sauvage est transporté vers la membrane plasmique dans mammifères cellules. Précédemment, nous avons effectué un écran axée sur la luminescence de haut débit (HTS) et identifié un groupe de chaperons pharmacologiques qui a sauvé le transport de la rhodopsine P23H d’ER à la membrane plasmique. Ici, en utilisant une méthode d’immunomarquage suivie d’une analyse d’imagerie de haute teneur, nous avons mesuré la quantité de protéines mutantes rhodopsine dans la cellule entière et sur la membrane plasmique. Cette méthode est instructive et efficace pour identifier le vrais succès des faux positifs suite HTS En outre, l’analyse d’image haute teneur nous a permis de quantifier plusieurs paramètres d’une expérience unique pour évaluer les propriétés pharmacologiques de chaque composé. À l’aide de ce test, nous avons analysé l’effet de 11 différents composés vers six mutants de rhodopsine RP associé, obtention d’un profil pharmacologique 2D pour une compréhension quantitative et qualitative sur la stabilité structurelle de ces mutants rhodopsine et l’efficacité de différents composés vers ces mutants.

Introduction

Repliement est impliqué dans la dystrophie musculaire, dégénérescence neuronale, ainsi que des maladies aveuglantes, y compris une rétinite pigmentaire (RP)1. RP est une dégénérescence rétinienne héréditaire et progressive associée à des mutations dans plus de 60 gènes affectant la fonction et l’homéostasie des photorécepteurs de la tige ou les épithéliums pigmenté rétinien (RPE)2,3. Aucun traitement efficace n’est actuellement disponible pour RP. Les mutations de rhodopsine représentent environ 25-30 % d’autosomique dominante (ad) cas RP. Parmi les plus de 150 rhodopsine mutations4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), les mutations de la classe II causent l’instabilité structurelle de la protéine de la rhodopsine qui contribue à la mort de photorécepteur de tige et vision perte5,6,7,8. Le P23H est la mutation de la rhodopsine plus fréquente en Amérique du Nord, qui est aussi un exemple typique de la classe II rhodopsine mutations9,10. En raison de son instabilité structurelle inhérente, la rhodopsine mal repliée s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re) dans les cellules de mammifères, alors que la rhodopsine de type sauvage est situé sur la membrane plasmique5. La rhodopsine mal repliée P23H expositions mutant dominant négative cytotoxicité qui ne résulte pas de SIM1, mais est liée à l’activation d’ER associés voie de dégradation des protéines et l’organisation du segment externe tige interrompu. Pour atténuer le stress de cellules photoréceptrices tige, une stratégie consiste à stabiliser le pliage native de la rhodopsine mutant à l’aide d’un chaperon pharmacologique.

Pour atteindre cet objectif, nous avons réalisé un écran de haut débit basés sur les cellules (EMD)11,12,13 à l’aide d’une analyse de complémentation de fragment de β-galactosidase à quantifier le mutant de rhodopsine P23H transporté sur le plasma membrane. Le protocole simple et robuste de ce test HTS nous a permis d’explorer les activités d’environ 79 000 petites molécules pour chaque écran. Toutefois, parce que ce dosage HTS lit les signaux de luminescence, faux positifs, y compris les inhibiteurs de la β-gal, composés colorés ou cytotoxiques sont inclus dans la liste de résultats en attente d’être identifiés par une analyse secondaire.

L’immunomarquage traditionnel et méthodes d’imagerie de fluorescence ont été utilisés pour les années d’étudier le transport de la rhodopsine dans les cellules de mammifères5,14,15,16. Cependant, ces méthodes conventionnelles ne peuvent servir à quantifier les effets pharmacologiques des composés de plus de 10 vers le transport de la rhodopsine, parce qu’une analyse d’imagerie fiable requiert un grand nombre d’images prises dans des conditions très cohérente, qui est pas amendables par les méthodes d’imagerie conventionnelles. Ici, nous avons développé un protocole d’imagerie de haute teneur immunostaining basé comme test secondaire pour quantifier le transport de surface cellulaire de rhodopsine mal repliées mutants11,13,17. Pour étiqueter rhodopsine sur la membrane plasmique, nous avons sauté l’étape de la perméabilisation de la membrane cellulaire et immunomarquage des mutants de la rhodopsine par un anticorps monoclonal anti-rhodopsine de (B6-30) reconnaissant l’épitope N-terminale de la rhodopsine du côté extracellulaire de la cellule membrane18. Pour visualiser la rhodopsine mutant dans la cellule entière, nous fondue rhodopsine avec la protéine de fluorescence de Vénus. De quantifier les intensités de fluorescence dans les canaux de fluorescence différents, nous sommes en mesure d’obtenir plusieurs paramètres d’une expérience unique dont l’intensité totale rhodopsine dans la cellule entière, sur la surface de la cellule et le ratio de fluorescence de rhodopsine sur la surface de la cellule à celle de la cellule entière. En appliquant cette méthode pour stabiliser les cellules exprimant un total de six mutants rhodopsine mal repliées, nous pouvons générer un profil pharmacologique de plusieurs petites molécules chaperons vers ces mutants. Dans ce protocole, toutes les cellules sont immunocolorées dans une plaque 384 puits et photographié à l’aide d’un système automatisé d’imagerie sous condition d’imagerie très cohérent. Une analyse de l’image est effectuée pour chaque puits, contenant des images de plus de 600 cellules pour réduire la variation due à l’hétérogénéité des cellules avec des variables de niveau d’expression de forme et de la protéine cellulaire. Le flux de travail de ce protocole est résumée dans la Figure 1. L’avantage de cette méthode est que nous obtenons images haute résolution ainsi que multiparamétriques quantifications de l’analyse axée sur l’image. En général, le présent protocole peut être modifié et appliqué pour quantifier le transport d’une protéine de membrane mal repliées d’intérêt.

Protocol

Remarque : La rhodopsine transport dosage. 1. préparation et la Culture de cellules Faire revivre cryoconservés U2OS stables cellules exprimant le type sauvage (WT) ou les protéines de fusion de rhodopsine-Vénus souris mutante. Décongeler les cellules à 37 ° C jusqu’à ce que seulement petits cristaux de glace sont laissés dans le flacon.Remarque : Les cellules U2OS sont utilisés dans le présent protocole parce qu’il n’y a aucune lignée de cellul…

Representative Results

Nous avons caractérisé le transport de la rhodopsine avec trois paramètres : l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (rhodopsine-Venus INT), l’intensité de l’immunomarquage de la rhodopsine sur la membrane plasmique (rhodopsine INT sur la surface des cellules) et le ratio de rhodopsin tache sur la surface de la cellule à l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (Ratio de MEM-Total). Un résultat représentatif de l’essai de transpor…

Discussion

Ici, nous avons montré un test d’imagerie haute teneur utilisé pour caractériser les hits identifiés d’une HTS L’automatisation seule impliquée dans ces protocoles est l’imageur de haute teneur. L’immunomarquage et imagerie de fluorescence de la rhodopsine ont été utilisés couramment pour caractériser la localisation de la rhodopsine5,14,15,16. Cependant, la quantification de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Mark E. Schurdak et l’Université de Pittsburgh Drug Discovery Institute for fournissant l’imageur haute teneur et des formations initiales. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) a généreusement partagé le 4 1 et des anticorps anti-rhodopsine B630. Le plasmide contenant le cDNA de souris rhodopsin-Venus construire était partagé par m. Nevin Lambert (Université de Augusta). Ce travail a été soutenu par l’Institut National d’octroi de santé EY024992 YC et P30EY008098 de grant de l’Université de Pittsburgh Vision Research Core.

Materials

U2OS (rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
DMEM high glucose Genesee Scientific 25-500 With L-Glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16140071 Heat inactivated
Plasmocin InvivoGen ant-mpt Mycoplasma elimination reagent
Penicillin-Streptomycin (100X) Gibco 15140122 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures
Trypsin-EDTA Genesee Scientific 25-510 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium
Poly-L-lysine solution Sigma-Aldrich P4707-50ML Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
CellCarrier-384 Ultra Microplates PerkinElmer 6057300 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis
Sterile 96-well plate Eppendorf 30730119 Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic
Phosphate Buffered Sailine (PBS) Invitrogen AM9625 10 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSO Sigma-Aldrich D4540 >99.5%, cell culture tested
9-cis-retinal Sigma-Aldrich R5754
Compounds tested Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized NA Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized
B6-30 anti-rhodopsin antibody Novus NBP2-25160 Gift from Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 115-165-146
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Methanol-free
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 50062Z Blocking buffer
Hoechst 33342, Trihydroch Invitrogen H3570 Nuclear staining solution
High-content imager Molecular Devices ImageXpress ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress high-content image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress High-content image acquisition and analysis software
Multichannel pipette (0.5-10 µL) Rainin 17013802 Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL
Multichannel pipette (0.5-10c Rainin 17013805 Manual 8-channel pipette, 20-200 µL
Electronic multichannel pipette (10-200 μL) Thermo Scientific 14-3879-56BT Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks
50ml Reagent Reservoir Genesee Scientific 28-125 Reagent reservior for multichannel pippte dispensing
8-Channel aspirator ABC Scientific EV503 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates
Excel spreadsheet software Microsoft Excel2016 The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation
Origin2018 scientific data analysis and graphing software OriginLab Origin2018 The data analysis software for generating the dose response curves

References

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
  5. Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
  6. Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
  7. Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
  8. Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
  9. Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
  10. Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
  11. Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  12. Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
  13. Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
  14. Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
  15. Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
  16. Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. 생화학. 33 (20), 6121-6128 (1994).
  17. Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
  18. Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
  22. Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
  23. Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).

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Cite This Article
Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58703, doi:10.3791/58703 (2019).

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