Summary

À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques

Published: January 07, 2019
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Summary

Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.

Abstract

La compréhension des maladies humaines a été considérablement élargie grâce à l’étude de modèles animaux. Néanmoins, histopathologique des modèles expérimentaux doit être aussi rigoureuse que celle appliquée pour les échantillons humains. En effet, tirer des conclusions fiables et précises critique dépend de la qualité de tissu section préparation. Nous décrivons ici un protocole pour l’analyse histopathologique des tissus murins qui implémente plusieurs étapes automatisées au cours de la procédure, de la préparation initiale à l’enrobage de paraffine des échantillons murines. La réduction des variables méthodologiques grâce à la normalisation du protocole rigoureux des procédures automatisées contribue à une plus grande fiabilité globale d’analyse pathologique murine. Plus précisément, ce protocole décrit l’utilisation d’un traitement automatisé et intégration de systèmes robotiques, couramment utilisées pour le traitement des tissus et enrobage de paraffine d’échantillons humains, pour traiter des spécimens murins d’inflammation intestinale. Nous concluons que la fiabilité de l’examen histopathologique des tissus murins est sensiblement augmentée lors de l’introduction de techniques standardisés et automatisés.

Introduction

Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour disséquer les mécanismes pathogènes conduisant à des maladies humaines1,2. Afin d’évaluer la gravité d’une maladie, les chercheurs doivent évaluer l’effet d’un traitement et étudier les variations architecturales cytologiques et histologiques ou le montant de l’inflammation,3. Pour effectuer sur ces modèles expérimentaux, des analyses détaillées histopathologiques sont nécessaires, souvent en comparant des échantillons murins et humains4,5.

En outre, des échantillons humains sont généralement traités et marqués par des installations de base histopathologie et expérimentés pathologistes humaines à travers standardisé critères histopathologiques et méthodes. À l’inverse, tissus murins sont habituellement fixes, intégrées et analysés par des chercheurs ayant une expérience limitée des protocoles histopathologiques. La qualité et la fiabilité de l’examen histopathologique commence par la préparation des coupes de tissus de haute qualité. Plusieurs facteurs contribuent critique pour augmenter ou diminuer la qualité de l’analyse finale, y compris la fixation, macroscopique de sectionnement, de transformation, de paraffine incorporation et incorporation des échantillons6,7.

Tous ces passages impliquant la manipulation de l’échantillon sont soumis à des erreurs manuelles, y compris l’intégration manuelle des échantillons et, dans une moindre mesure, manuel microtome de sectionnement et de coloration. À l’heure actuelle, l’ensemble du processus de préparation de tissus murins pour évaluation histologique repose sur des protocoles qui varient d’un laboratoire à et protocoles manuelles. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre des protocoles standardisés et automatisés pour réduire les erreurs et la variabilité dans l’examen histopathologique murine.

À notre connaissance, nous décrivons ici les premiers protocoles pour tissu entièrement automatisé de traitement et d’incorporation d’évaluation histologique des tissus murins ; Ces sont couramment utilisées dans les unités de pathologie pour les analyses d’échantillons humains. Un exemple concret de la faisabilité de la méthode, un modèle murin d’inflammation intestinale a été analysé, c’est-à-dire, le modèle de colite chronique causée par l’ingestion répétée de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans l’eau potable8 ,9. Ce paramètre expérimental étroitement ressemble à humaine inflammatoire de l’intestin (IBD) les maladies10 car les animaux traités DSS montrent des signes d’inflammation intestinale, par exemple, perte de poids, selles ou diarrhée et raccourcissement de la colon ainsi que la fibrose 8,9,11. Tel qu’observé pour des patients humains IBD, traitement DSS génère une évolution de la maladie complexe. Dans ce contexte, évaluations histologiques complexes sont nécessaires pour comprendre la profonde altération de l’architecture du tissu. Ainsi, la mise en œuvre des protocoles décrits pour augmenter la qualité de préparation d’échantillon peut-être bénéficier des chercheurs en se fondant sur l’interprétation de histologique et immunohistochimique analyse des paramètres expérimentaux murins. Des modèles expérimentaux murins de maladies humaines impliquant des modifications de l’architecture tissulaire, la présence d’infiltration du tissu cellulaire ou d’inflammation dans différents tissus et organes (intestin, cerveau, foie, peau) pourrait utiliser la qualité accrue de la préparation d’échantillons pour examen histopathologique.

Protocol

Procédures d’animaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (auth. 127/15 27/13) et suivait les directives de protection des animaux de l’Institut européen d’oncologie IACUC (Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme) 1. chronique de colite Induction par Administration de DSS répétitives Séparé âge et le sexe correspondant souris en 2 groupes (traitement DSS vs contrôle H2O, au moins 5 autres souris par groupe expérimental).</li…

Representative Results

Colite chronique expérimentale induite par l’administration répétée de DSS dans l’eau potable est un modèle murin d’inflammation intestinale ressemblant humaine EIA8,9. La figure 1 décrit les effets du traitement de DSS, y compris le côlon raccourcissement (Figure 1 a), un paramètre utilisé pour marquer la présence de l’inflammation induite par le DSS et…

Discussion

Nous utilisons différentes étapes automatisées lors de la préparation des tissus murins pour l’analyse histopathologique. Ce protocole vise à fournir des conseils techniques pour augmenter la reproductibilité et la standardisation de l’ensemble du processus, ce qui améliore la qualité globale de l’évaluation finale histopathologique. Nous avons implémenté des instruments automatisés et méthodes pour la préparation et l’incorporation de tissus, couramment utilisés dans des installations de centrales…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le département de pathologie de l’hôpital Policlinico IRCCS, Milan pour le support technique et l’IEO Animal Facility d’assistance dans l’élevage.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

References

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
  7. Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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Cite This Article
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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