Summary

Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

Published: November 28, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Spermatozoan Membran Integrität, eine zelluläre Funktion verbunden mit Sperma Befruchtung Kompetenz zu bewerten. Wir beschreiben drei Techniken für die fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen: gleichzeitige Färbung mit spezifischen fluoreszierende Sonden, Fluoreszenz-Mikroskopie und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie. Beispiele für die Kombination der Methoden werden ebenfalls vorgestellt.

Abstract

Standard Spermiograms beschreiben Spermienqualität basieren meist auf die physiologischen und visuelle Parameter wie Ejakulatvolumen und Konzentration, Motilität und progressive Motilität und Morphologie der Spermien und Lebensfähigkeit. Keiner dieser Bewertungen ist jedoch gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Da die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien und potenzielle Befruchtung Membran Integrität und intrazellulären Funktionalität abhängt, könnte Bewertung dieser Parameter eine bessere Vorhersage der Spermien Befruchtung Kompetenz ermöglichen. Hier beschreiben wir drei machbare Methoden zur Beurteilung der Spermienqualität mit spezifischen fluoreszierende Sonden kombiniert mit Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow-Zytometrie-Analysen. Analysen beurteilt Plasmamembran Integrität mit 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Propidium Jodid (PI), acrosomal Membran Integrität mit Fluorescein erfolgt konjugiert Pisum Sativum Agglutinin (FITC-PSA) und Mitochondrien-Membran Integrität mit 5, 5′, 6, 6′-Tetra-Chloro-1, 1′, 3, 3′-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1). Kombinationen dieser Methoden werden ebenfalls vorgestellt. Zum Beispiel kombinierten Einsatz von annexin V mit PI Fluorochromes ermöglicht Apoptose Bewertung und Berechnung des apoptotischen Spermien (Apoptose-Index). Wir glauben, dass diese Methoden, die bei der Prüfung der Samenzelle Membranen basieren, sehr nützlich für die Bewertung der Qualität der Spermien sind.

Introduction

Integrität und Funktionalität der Spermien Membranen sind einige der Angabe Lebensfähigkeit der Spermien und Befruchtung mögliche Faktoren. Die Plasmamembran wirkt wie eine Barriere zwischen den intrazellulären und extrazellulären Abteilen, damit Aufrechterhaltung der zellulären osmotische Gleichgewicht1. Stress, die Schäden an der Plasmamembran Integrität induziert möglicherweise beeinträchtigen Homöostase, Lebensfähigkeit und Düngung Kapazität reduzieren und Zelltod zu erhöhen. Beispielsweise reduziert Kryokonservierung Lebensfähigkeit der Spermien durch zu Schäden an der Plasmamembran infolge Temperaturänderungen und osmotischen Stress2. Wir berichteten bereits, dass auszusetzen Bullensperma niedrigen Konzentrationen von lebensmittelbedingten Schadstoffe wie Pestizide Atrazin, seine wichtigsten Metaboliten Diaminochlorotriazine oder Mykotoxine Aflatoxin B1, reduziert Spermien Rentabilität1,3 . Dies wurde durch Kennzeichnung der doppelsträngigen DNS mit DAPI in Kombination mit PI, die bindet an die DNA von Zellen mit einer beschädigten Plasmamembran bestimmt.

Akrosom Reaktion (AR) beinhaltet Verschmelzung der äußeren Akrosom Membran und die darüber liegende Plasmamembran, was die Auflösung von acrosomal Enzymen4,5. Dies sind wesentliche Ereignisse für die Zona Pellucida eindringen und weitere Zusammenführung der Samenzellen mit der Eizelle6. Bewertung der acrosomal Membran Integrität somit einen nützlichen Parameter zur Bewertung der Qualität des Spermas und männliche Ergiebigkeit7,8,9. Verschiedene fluoreszierende Techniken eignen sich für die Überprüfung der Integrität von Akrosom, FITC-PNA oder FITC-PSA8,10. In unseren früheren Studien mit den Mustern der FITC-PSA Färbung1,3wir versehen genaue Definitionen für (i) intakt Akrosom, (Ii) Akrosom Membran beschädigt und (Iii) reagierten Akrosom. Im aktuellen Bericht wir bewerten Akrosom Status mithilfe von Spermien gewidmet Durchflusszytometrie und vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen mit Fluoreszenz-Mikroskopie.

Die Mitochondrien sind multifunktionale Organellen beteiligt, unter anderem ATP Synthese, reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion, Kalzium-Signalisierung und Apoptose. Physiologische Störungen, einschließlich der männlichen und weiblichen Unfruchtbarkeit sind veränderte Funktion der Mitochondrien11zugeordnet. Spermien Mitochondrien sind in der Midpiece angeordnet und spielen eine entscheidende Rolle in der Spermien-Motilität-12. Es wird gut angenommen, dass hohe mitochondriale Membranpotential (ΔΨm) normale Motilität und hoher Düngung Kapazität13zugeordnet ist. Im Gegensatz dazu niedrig ΔΨm ist verbunden mit einer erhöhten Niveau von reaktiven Sauerstoffspezies und Befruchtung Rate14reduziert. Dennoch können verschiedene ökologische Verbindungen, z.B. endokrine Disruptoren zellulären Stress auslösen und führen zu einem vorübergehenden Anstieg der ΔΨm, Hyperpolarisation1,3, erhöhte Produktion von freien Radikalen und schließlich, Apoptose-15. Die fluoreszierende Sonde 5, 5′, 6, 6′-Tetra-Chloro-1, 1′, 3, 3′-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1) ermöglicht die Untersuchung beispielsweise die Auswirkungen der Foodborne Giftstoffe auf Sperma ΔΨm1,3.

Standard Spermiograms, basierend auf physiologische und morphologische Parameter sind nicht gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Genauere Methoden sind erforderlich, um Spermien-Qualität zu gewährleisten. Hier bieten wir zwei praktikable Methoden zur Bestimmung Spermienqualität basierend auf Bewertungen von Spermien Membranen: gleichzeitige vierfach Färbung mit speziellen fluoreszierenden Sonden und Fluoreszenz-Mikroskopie, beschrieben in unserem Studien-1,3 und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie, vor kurzem in unserem Labor und bereits von anderen verwendet16,17,18.

Protocol

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den israelischen Leitlinien von 1994 für den Tierschutz. Bovine Sperma geliefert wurde von israelischen Handelsgesellschaft für künstliche Befruchtung und Zucht. Ejakuliert 11 Bullen wurden in dieser Studie ausgewertet. 1. Sperma Probenaufbereitung Hinweis: Das Verfahren basiert auf der Roth Labor Protokoll1,3. Erhalt…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt simultan fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen (Plasma, acrosomal und Mitochondrien) mithilfe von PI, DAPI, FITC-PSA und JC-1. Beurteilung der Spermien Membranen mit gleichzeitiger Färbung mit vier fluoreszierende Sonden ermöglicht beispielsweise Bewertung des Anteils der Spermien in den einzelnen Kategorien – Leben vs. tot; hohe vs. niedrige ΔΨm; intakte Vs. Akrosom beschädigt – gleichzeitig…

Discussion

Sperma Befruchtung potenzielle hängt von mehrere Faktoren die Qualität widerspiegelt. Eine hohe Konzentration der Spermien und einen hohen Anteil an sehr progressiv bewegliche Spermien könnte qualitativ hochwertige Samen betrachtet werden. Dennoch, eine solche Bewertung nicht berücksichtigt andere zelluläre und funktionelle Parameter. Die Verwendung von “Bench-Top” Microcapillary Durchflusszytometer kann zur Bewertung der verschiedenen Spermien Strukturen mit fluoreszierenden Sonden, wie zuvor von anderen<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten “SION” israelische Gesellschaft für künstliche Befruchtung und Zucht (Hafetz-Haim, Israel) Danke für ihre Hilfe und Zusammenarbeit und Frau Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Frankreich) für die Unterstützung bei der Inbetriebnahme und Schulung.

Materials

NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20X stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

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Cite This Article
Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

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