Summary

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Published: November 28, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Abstract

Standaard spermiograms beschrijving van de kwaliteit van het sperma zijn meestal gebaseerd op de fysiologische en visuele parameters, zoals het volume van ejaculaat en concentratie, beweeglijkheid en progressieve mobiliteit, en sperma morfologie en levensvatbaarheid. Echter, geen van deze evaluaties is goed genoeg om te voorspellen van de kwaliteit van sperma. Gezien het feit dat onderhoud van sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële hangt af van membraan integriteit en intracellulaire functionaliteit, evaluatie van deze parameters in staat kan stellen een betere voorspelling van sperma bevruchting bevoegdheid. Hier beschrijven we drie haalbare methoden voor evaluatie van de kwaliteit van het sperma met behulp van specifieke fluorescerende sondes gecombineerd met fluorescentie microscopie en stroom cytometry analyses. Analyses beoordeeld plasmamembraan integriteit met behulp van 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en propidium jodide (PI), acrosomal membraan integriteit met fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) en mitochondriale membraan integriteit met behulp van 5, 5′, 6, 6′-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1). Combinaties van deze methoden worden ook gepresenteerd. Bijvoorbeeld, gebruik van Annexine V gecombineerd met PI fluorochromes maakt beoordeling van apoptosis en de berekening van het aandeel van apoptotic sperma (apoptotic index). Wij zijn van mening dat deze methodieken, die gebaseerd zijn op het onderzoek van de zaadcel membranen, zeer nuttig voor de beoordeling van de kwaliteit van het sperma zijn.

Introduction

Integriteit en functionaliteit van sperma membranen zijn enkele van de factoren die sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële aangeeft. Het plasma-membraan fungeert als een beveiligingsbarrière tussen intracellulaire en extracellulaire compartimenten, waardoor het behoud van de cellulaire osmotische evenwicht1. Elke stress die schade aan de integriteit van het plasmamembraan induceert kan afbreuk doen aan de homeostase, levensvatbaarheid en bevruchting capaciteitsvermindering en verhogen van celdood. Bijvoorbeeld, vermindert cryopreservatie sperma levensvatbaarheid verschuldigd aan schade aan haar plasmamembraan, als gevolg van temperatuurveranderingen en osmotische stress2. We eerder gemeld dat het sperma van de stier aan lage concentraties van foodborne contaminanten zoals het pesticide atrazine, haar belangrijkste metaboliet diaminochlorotriazine of de mycotoxine aflatoxine B1, bloot vermindert sperma levensvatbaarheid1,3 . Dit werd bepaald door het dubbelstrengig DNA met DAPI labeling in combinatie met PI, dat aan het DNA van cellen met een beschadigde plasma-membraan bindt.

Acrosoom reactie (AR) gaat de fusie van de buitenste Acrosoom membraan en de bovenliggende plasmamembraan resulterend in de release van acrosomal enzymen4,5. Dit zijn essentiële gebeurtenissen voor zona-zitten penetratie en verdere samenvoegen van de zaadcellen met de oöcyt6. Evaluatie van acrosomal membraan integriteit vormt daarom een nuttige parameter om de kwaliteit van het sperma en de mannelijke vruchtbaarheid7,8,9te evalueren. Verschillende TL technieken zijn geschikt voor de verificatie van de integriteit van het Acrosoom, FITC-PNA of FITC-PSA8,10. In onze eerdere studies, met behulp van de patronen van FITC-PSA kleuring1,3, wij nauwkeurige definities voor (i) intact Acrosoom, (ii) beschadigd Acrosoom membraan en (iii) reageerde Acrosoom. In het onderhavige verslag, we behulp van sperma-dedicated stroom cytometry van de status van de Acrosoom evalueren en vergelijken de resultaten met behulp van fluorescentie microscopie.

De mitochondriën zijn multifunctionele organellen betrokken in, onder andere dingen, ATP synthese, reactieve zuurstof soorten productie, calcium signalering en apoptosis. Fysiologische stoornissen, met inbegrip van mannelijke en vrouwelijke onvruchtbaarheid, zijn gekoppeld aan gewijzigde mitochondriale functie11. Sperma mitochondriën zijn gerangschikt in de midpiece en een cruciale rol in12beweeglijkheid van sperma. Het wordt goed geaccepteerd dat hoge Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) geassocieerd met normale beweeglijkheid en hoge bevruchting capaciteit13 wordt. In tegenstelling, lage ΔΨm wordt geassocieerd met een verhoogd niveau van reactieve zuurstof soorten en bevruchting tarief14verminderd. Niettemin, verschillende ecologische verbindingen, bijvoorbeeld endocriene verstoorders, kunnen induceren van cellulaire spanning en leiden tot een tijdelijke toename van de ΔΨm, hyperpolarisatie1,3, verhoogde productie van vrije radicalen en uiteindelijk, Apoptosis15. De fluorescente sonde 5, 5′, 6, 6′-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1) kan bijvoorbeeld onderzoek naar de effecten van foodborne toxines op sperma ΔΨm1,3.

Standaard spermiograms, op basis van fysiologische en morfologische parameters, zijn niet goed genoeg om te voorspellen sperma kwaliteit. Nauwkeuriger methoden zijn verplicht om de kwaliteit van het sperma. Hier bieden we twee haalbaar methoden voor het bepalen van de kwaliteit van het sperma op basis van evaluaties van sperma membranen: gelijktijdige vierpersoonskamers kleuring met specifieke fluorescerende sondes en fluorescentie microscopie, beschreven in onze studies1,3 en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry, onlangs gebruikt in ons laboratorium, en al worden gebruikt door anderen16,17,18.

Protocol

Alle van de experimenten werden uitgevoerd volgens de Israëlische richtsnoeren van 1994 voor het welzijn van dieren. Boviene sperma werd geleverd door Israëlische handelsvennootschap voor kunstmatige inseminatie en fokken. Ejaculeert van 11 stieren werden in deze studie geëvalueerd. 1. sperma proeven voorbereiding Opmerking: De procedure is gebaseerd op het Roth laboratory’s protocol1,3.</p…

Representative Results

Figuur 1 toont gelijktijdige fluorimetrische beoordeling van sperma membranen (plasma, acrosomal en mitochondriale) met behulp van PI, DAPI, FITC-PSA en JC-1. Beoordeling van sperma membranen met behulp van gelijktijdige kleuring met vier TL sondes toelaat, bijvoorbeeld, evaluatie van het aandeel van zaadcellen in elke categorie — live vs. doden; hoge vs. lage ΔΨm; intact vs. beschadigd Acrosoom — gelijktijdig voor elke zaadce…

Discussion

Sperma bevruchting potentiële hangt af van meerdere factoren als gevolg van de kwaliteit. Een hoge concentratie van spermatozoïden en een groot aantal zeer geleidelijk motile spermacellen kunnen hoge kwaliteit sperma te worden overwogen. Echter een dergelijke evaluatie doet niet rekening houden met andere cellulaire en functionele parameters. Het gebruik van ‘bench-top’ microcapillary stroom cytometer kunnen gemakkelijk aan te passen aan de evaluatie van verschillende sperma structuren met behulp van fluorescerende son…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank “SION” Israëlische bedrijf voor kunstmatige inseminatie en fokken (Hafetz-Haim, Israël) voor hun hulp en samenwerking, en mevrouw Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Frankrijk) voor hulp bij de installatie van het instrument en de opleiding.

Materials

NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20X stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Play Video

Cite This Article
Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

View Video