Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración
Summary
Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EVs) son recién descubiertos componentes subcelulares que desempeñan papeles importantes en muchos biológico funciones de señalización durante los Estados fisiológicos y patológicos. El aislamiento de los vehículos eléctricos continúa siendo un desafío importante en este campo, debido a las limitaciones intrínsecas a cada técnica. La ultracentrifugación diferencial con el método de centrifugación del gradiente de densidad es un enfoque utilizado y se considera que el procedimiento estándar de oro para el aislamiento de EV. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo, mano de obra intensiva y generalmente resulta en baja escalabilidad, que puede no ser adecuado para muestras de pequeño volumen como el lavado broncoalveolar. Demostramos que un método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración es simple y tiempo y mano de obra eficiente todavía proporciona un rendimiento de alta recuperación y pureza. Proponemos que este método de aislamiento podría ser una alternativa adecuada para el aislamiento de EV, particularmente para pequeño volumen de especímenes biológicos.
Introduction
Exosomas son el subconjunto más pequeño de los vehículos eléctricos, 50-200 nm de diámetro y tienen múltiples funciones biológicas a través de una amplia gama de señalización de procesos1,2,3,4,5. Gobiernan la homeostasis celular y el tejido sobre todo facilitando la comunicación intercelular a través de moléculas de carga tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos6,7,8,9 . Un paso crítico en la investigación EV es el proceso de aislamiento. Ultracentrifugación diferencial (UC), con o sin centrifugación de gradiente de densidad (DGC), se considera el enfoque de patrón oro, pero este método tiene limitaciones importantes, incluidos los porcentajes de recuperación de EV ineficientes y escalabilidad baja10 , 11 , 12, restringir su mejor utilización para muestras de volumen más grandes, tales como muestras de la célula cultura exosomas sobrenadante o alta producción. Las ventajas y desventajas de otros métodos, como la exclusión del tamaño por ultrafiltración o cromatografía de inmunoafinidad aislamiento por granos o columnas y microfluídica, están bien descritas, y se han desarrollado modernos procedimientos suplementarios para superar y minimizar limitaciones técnicas en cada enfoque11,12,13,14,15. Otros han demostrado que una centrifugación ultrafiltración (UFC) con una membrana nanoporosa en la unidad de filtración es una técnica alternativa que proporciona pureza comparable a una UC método16,17,18. Esta técnica podría considerarse como uno de los métodos de aislamiento alternativos.
Lavado broncoalveolar (BALF) contiene EVs que poseen numerosas funciones biológicas en diferentes afecciones respiratorias19,20,21,22. Estudio de EVs BALF derivados conlleva algunos problemas debido a la invasividad del procedimiento de broncoscopia en los seres humanos, así como una cantidad limitada de recuperación de líquido de lavado. En animales de laboratorio pequeños tales como ratones, sólo unos pocos mililitros pueden recuperarse en afecciones pulmonares normales, mucho menos en los pulmones inflamados o fibrótica23. Por lo tanto, recoger una cantidad suficiente de BALF para aislamiento de EV por una ultracentrifugación diferencial para aplicaciones posteriores puede no ser factible. Sin embargo, aislando poblaciones EV correcto es un factor crucial para el estudio de las funciones biológicas de la EV. El delicado equilibrio entre la eficiencia y eficacia continúa siendo un desafío en métodos de aislamiento de EV bien establecidos.
En este estudio, demostramos que un enfoque de ultrafiltración centrífugo, utilizando una unidad de filtro del 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte nanomembrane, es conveniente para pequeño volumen de muestra biológica como BALF. Esta técnica es simple, eficaz y proporciona escalabilidad para apoyar el estudio de los vehículos eléctricos derivados de BALF y alta pureza.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las últimas décadas, los científicos han desentrañando los significados de EVs en la homeostasis celular. Más importante aún, EVs desempeñan un papel importante en muchos procesos de la enfermedad mediante la modulación de las células vecinas y distantes a través de sus bioactivos carga moléculas1,21,22,26,27 , 28</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo es apoyado por las donaciones NHLBI/NIH HL103868 (para PC) y HL137076 (para PC), el americano corazón Asociación subvenciones (para PC) y el Premio de investigación de cáncer de Samuel Oschin integral cáncer Institute (SOCCI) pulmón (para PC). Nos gustaría expresar nuestro gran agradecimiento al Instituto del corazón de Smidt en el Cedars-Sinai Medical Center que nos proporciona una máquina Nanosight para EV nanopartículas análisis de seguimiento.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. 암 연구학. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
