Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration
Summary
Nous décrivons ici les deux protocoles d’isolement vésicule extracellulaire, centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité, d’isoler des vésicules extracellulaires des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire murine. Les vésicules extracellulaires dérivés du murin de lavage bronchoalvéolaire par ces deux méthodes sont quantifiés et caractérisés.
Abstract
Vésicules extracellulaires (EVs) sont des composants subcellulaires nouvellement découverts qui jouent un rôle important dans de nombreux biologique des fonctions de signalisation lors d’États physiologiques et pathologiques. L’isolement du SVE demeure un défi majeur dans ce domaine, en raison des limites inhérentes à chaque technique. L’ultracentrifugation différentielle avec la méthode de centrifugation en gradient de densité est une approche couramment utilisée et est considérée comme la procédure de l’étalon-or pour l’isolement de l’EV. Toutefois, cette procédure est longue et fastidieuse et donne généralement lieu à faible évolutivité, qui peut ne pas convenir pour les petits échantillons comme liquide de lavage broncho-alvéolaire. Nous démontrons qu’une méthode d’isolement de centrifugation ultrafiltration est simple et efficace-temps et travail encore fournit un rendement élevé de récupération et la pureté. Nous proposons que cette méthode d’isolement pourrait être une approche alternative qui convient pour l’isolation de l’EV, particulièrement pour les petits spécimens biologiques.
Introduction
Exosomes sont le plus petit sous-ensemble du SVE, 50 à 200 nm de diamètre et ont plusieurs fonctions biologiques à travers un large éventail de processus1,2,3,4,5de signalisation. Elles régissent l’homéostasie cellulaire et tissulaire principalement en facilitant la communication intercellulaire par l’intermédiaire de molécules de fret comme les lipides, les protéines et acides nucléiques6,7,8,9 . Une étape critique dans la recherche de l’EV est le processus d’isolement. Ultracentrifugation différentielle (UC), avec ou sans la centrifugation en gradient de densité (DGC), est considéré comme l’approche de l’étalon-or, mais cette méthode comporte des limites importantes, y compris les taux de récupération des EV inefficaces et faible évolutivité10 , 11 , 12, qui limitent sa meilleure utilisation de plus grands échantillons de volume, comme cell culture exosome surnageant ou haute production. Les avantages et les inconvénients des autres méthodes, telles que l’exclusion de taille par ultrafiltration ou chromatographie d’immunoaffinité isolation par perles ou colonnes et microfluidique, sont bien décrits, et des procédures supplémentaires modernes ont été développés pour surmonter et réduire au minimum les limitations techniques dans chaque approche11,12,13,14,15. D’autres ont montré qu’une centrifugation d’ultrafiltration (UFC) par une membrane NANOPOREUSE dans l’unité de filtration est une technique alternative qui assure une pureté comparable à une UC méthode16,17,18. Cette technique pourrait être considérée comme une des méthodes alternatives d’isolation.
Lavage bronchoalvéolaire (LLBA) contient le serveur virtuel Exchange qui possède de nombreuses fonctions biologiques dans diverses affections respiratoires19,20,21,22. Étudier EVs BALF dérivés implique certains défis en raison de l’empiétement que constitue la procédure bronchoscopie chez l’homme, mais aussi une quantité limitée de récupération liquide de lavage. Petits animaux de laboratoire comme les souris, seulement quelques millilitres peuvent être récupérés dans des conditions normales de poumon, encore moins dans les poumons enflammés ou fibreuses23. Par conséquent, recueillir une quantité suffisante de BALF pour EV isolement par une ultracentrifugation différentielle pour les applications en aval ne peut être réalisable. Cependant, les populations EV correctes est d’isoler un facteur crucial pour l’étude des fonctions biologiques EV. Le fragile équilibre entre l’efficience et l’efficacité continue d’être un défi dans les méthodes d’isolation EV bien établies.
Dans cette étude, nous montrons qu’une approche de l’ultrafiltration centrifuge, utilisant une unité de filtration 100 kDa poids moléculaire limite (MWCO) nanomembrane, est adaptée aux petits échantillons biologiques tels que BALF. Cette technique est simple, efficace et fournit la haute pureté et évolutivité pour soutenir l’étude des dérivés BALF EVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les dernières décennies, les scientifiques ont démêlé les significations du SVE dans l’homéostasie cellulaire. Plus important encore, les EVs jouent un rôle important dans de nombreux processus de maladie en modulant les cellules voisines et lointaines à leur cargaison bioactifs molécules1,21,22,26,27 , 28 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail est soutenu par les subventions NHLBI/NIH HL103868 (à C.P.) et HL137076 (à C.P.), l’American Heart Association subvention (à C.P.) et le Samuel Oschin complets Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (à C.P.). Nous tenons à exprimer notre vive reconnaissance à l’Institut de cardiologie de Smidt au Cedars-Sinai Medical Center qui nous fournit une machine Nanosight pour EV NANOPARTICULE analyse de suivi.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
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