Summary

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Published: October 08, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

Abstract

שחפת mycobacterium נמצא כעת הקטלני פתוגניות גורם 1.7 מיליון מקרי מוות וזיהומים 10.4 מליון בכל שנה. חשיפה חיידק זה גורם ספקטרום רחב המחלה בבני אדם ועד זיהום סטיריליים מחלה קטלנית מתקדם באופן פעיל. הצורה השכיחה ביותר היא ראגנטים, אשר ללא תסמינים, אבל יש את היכולת להפעיל מחדש לתוך מחלה לפתח. דג זברה למבוגרים ופתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית לאחרונה הוכיחו להיות מודל החל ללמוד את קשת רחב מחלת השחפת. חשוב לציין, השהיה ספונטנית, הפעלה מחדש, כמו גם תגובות מערכת החיסון מסתגלת בהקשר של זיהום mycobacterial ניתן יהיה ללמוד במודל זה. במאמר זה, אנו מתארים שיטות זיהום ניסיוני של דג זברה למבוגרים, האוסף של איברים פנימיים להפקת חומצות גרעין לשקילת נטען mycobacterial, מארח תגובות מערכת החיסון על ידי ה-PCR כמותי. In-הבית מפותחות, ספציפית qPCR assay מ התחממות עולמית –רגיש יותר מאשר בשיטות ציפוי מסורתי בעת גם זיהוי ה-DNA של mycobacteria ללא הפרדה, רדום או מת לאחרונה. כמו גם DNA ו- RNA המחולצים באותו הפרט, זה אפשרי ללמוד את קשרי הגומלין בין המדינה חולה, את המחשב המארח ופתוגן, ביטוי הגנים. המודל דג זברה בוגרת שחפת וכך מציג את עצמו כמערכת מאוד רלוונטי, ללא מידע יונקים ויוו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי.

Introduction

דג זברה (רזבורה rerio) הוא מודל בעל חיים הנמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי וזה מודל מקובל עבור הביולוגיה חוליות נפוצות. דג זברה הותאם לשדות רבים של מחקר מידול מחלות אנושיות, הפרעות ועד סרטן1 ומחלות לב2 זיהום ולימודי אימונולוגי של מספר חיידקים 3 וזיהומים וירליים4 , 5. בנוסף, הפיתוח לשעבר עם רחם של דג זברה עוברי גרם דג זברה מודל פופולרי ב ביולוגיה התפתחותית6 וטוקסיקולוגיה7,8.

בתחומים רבים של מחקר, כולל זיהום ביולוגיה, הזחלים דג זברה שקוף אופטית משמשים. תאי מערכת החיסון הראשון להופיע בתוך 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), כאשר מקרופאגים פרימיטיביים שזוהו9. הנויטרופילים הם תאים חיסוניים הבאה תופיע hpf סביב 3310. דג זברה הזחלים הם לפיכך ריאלי עבור לימוד בשלבים המוקדמים של הזיהום ואת התפקיד של חסינות מולד בהיעדרו של תאים חיסוניים מסתגלת11. עם זאת, דג זברה למבוגרים עם המערכת החיסונית מסתגלת באופן תקין שלה מספק שכבה חדשה של מורכבות לניסויים זיהום. תאי T ניתן להבחין סביב 3 ימים לפרסם הפריה12, ואף בתאי B מסוגלים לייצר נוגדנים תפקודית 4 שבועות-פוסט-דישון-13. דג זברה למבוגרים יש את כל עמיתיהם העיקריים של המערכת החיסונית יונקים, מולדת, גמישים. ההבדלים העיקריים בין את immune systems של דגים ובני נמצאים נוגדנים isotypes באותה מידה כמו האנטומיה של רקמות הלימפה. דג זברה יש נוגדנים רק שלושה שיעורים14, ואילו לבני האדם יש חמש15. בהיעדרו של מח העצם ואת בלוטות הלימפה, איברי הלימפה העיקרי ב הדג הכליה ואת ה התימוס16 הטחול, הכליה, הבטן לשמש איברי הלימפה משני17. למרות הבדלים אלה, עם ארסנל מלא המערכת החיסונית שלה של תאים מולדת, גמישים, דג זברה למבוגרים הוא מודל מאוד רלוונטי, קל לשימוש, ללא מידע יונקים ללימודי אינטראקציה פתוגן-פונדקאי.

דג זברה הוקם לאחרונה כמודל אפשרי ללמוד שחפת18,19,20,21,22. השחפת היא מחלה מוטס הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium. על פי ארגון הבריאות העולמי, שחפת גרמה1.7 מיליון מקרי מוות של 2016, והוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם פתוגן יחיד23. עכברים24,25, ארנבים26 וקופים27 הם שהחיה הידועים מודלים במחקר שחפת אבל כל המגבלות שלהם. המודל אנושיות הפרימטים לזיהום מ. שחפת דומה המחלה האדם הקרוב ביותר, אבל באמצעות מודל זה הוא מוגבל בשל שיקולים אתיים רציני. דגמים בעלי חיים אחרים הם מוגבל בשל המארח-יחודיות של מ. שחפת המשפיעה על המחלה פתולוגיה. כנראה הבעיה הגדולה ביותר ב דוגמנות שחפת הוא המגוון הרחב של תוצאות בזיהומים ומחלות של המחלה האנושית: השחפת היא מחלה מאוד הטרוגנית החל לחיטוי חסינות נסתר, פעיל, שהופעלה מחדש זיהום28 , אשר יכול להיות קשה לשחזר את מודל השפעול.

התחממות עולמית הוא קרוב משפחה של מ. שחפת עם חלבונים orthologous ~ 3000 עם 85% חומצה אמינית זהות29. התחממות עולמית מ מדביק באופן טבעי דג זברה לייצר גרנולומות, גולת הכותרת של שחפת, ב19,האיברים הפנימיים שלה30. בניגוד דגמים בעלי חיים אחרים השתמשו במחקר שחפת, דג זברה מייצר צאצאים רבים, היא דורשת רק מקום מוגבל, חשוב, זה neurophysiologically המודל שחפת חוליות שהיזמים זמינים. בנוסף, הזיהום מ התחממות עולמית גורם חבויה, מחלה פעילה או אפילו עיקור של זיהום mycobacterial דג זברה בוגרת מקרוב מחקה את הספקטרום של המחלה תוצאות של שחפת אנוש19, 31 , 32. כאן, אנו מתארים שיטות עבור הדגם שחפת ניסיוני של דג זברה למבוגרים על ידי הזרקת התחממות עולמית מ לתוך חלל הבטן באמצעות PCR כמותי כדי למדוד המון mycobacterial של תגובות חיסוניות של דג זברה דגימות רקמה.

Protocol

כל דג זברה ניסויים אושרו על ידי מועצת המנהלים ניסוי חיה ב פינלנד (ESAVI/8245/04.10.07/2015). שיטות מבוצעות על פי החוק (497/2013) צו ממשלתי (564/2013) בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות או חינוכי בפינלנד. 1. culturing של התחממות עולמית הערה: מאחר התחממות עולמית חיידק המסוג?…

Representative Results

המחלה טבעי דגים התחממות עולמית משפיע על האיברים הפנימיים של דג זברה ומייצרת זיהום מערכתי עם גרנולומות בהיסטולוגיה גלוי19. דג זברה בוגרת נגועים מ התחממות עולמית על ידי זריקה בקרום הבטן. ה-DNA ו RNA המחולצים ולאחר העומס mycobacterial נמדד על ידי כמותיים תגובת ש…

Discussion

כאן נתאר יישום מבוסס-qPCR כדי למדוד המון mycobacterial מ- DNA מופק דג זברה בוגרת השפעול נגוע רקמות. יישום זה מבוסס על תחל עוצב סביב ה 16-23S rRNA פנימי מרווח משועתקים רצף40. העומס mycobacterial הכולל דוגמאות הדגים מוערכת באמצעות עיקול רגיל שהוכנו מ- DNA מופק מספר ידוע של mycobacteria בתרבית, בהנחה שהחיידק אח?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו היא נתמכה על ידי פינית תרבותית קרן (מרגשת), קרן שחפת טמפרה (ה. ל., ל’-M.V., M.M.H., ד. נ), הקרן של האגודה נגד שחפת פינית (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (מרגשת, M.M.H., ד. נ), סיגריד Jusélius קרן (ד. נ), אמיל Aaltonen קרן (M.M.H.), ג’יין, קרן Erkko Aatos (ד. נ), האקדמיה של פינלנד (ד. נ). לינה Mäkinen, חנה-לינה Piippo, ג’נה Ilomäki הם הכירו לסיוע טכני שלהם. המחברים להכיר המעבדה דג זברה טמפרה עבור השירות שלהם.

Materials

Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 ml homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

References

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  24. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  25. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  26. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  27. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  28. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  29. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  30. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  31. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  32. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  33. Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  34. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
  35. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  36. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  37. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  38. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  39. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  40. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  41. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  42. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  43. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  44. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  45. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Play Video

Cite This Article
Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

View Video