Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme
Summary
Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Abstract
Mycobacterium tüberküloz Şu anda en ölümcül insan patojen 1.7 milyon ölüm ve 10.4 milyon enfeksiyonları her yıl neden olduğunu. Maruz kalma bu bakteri steril bir enfeksiyondan aktif olarak devam eden bir ölümcül hastalık arasında değişen insanlarda geniş hastalığı spektrum neden olur. Asemptomatik, ama bir fulminan hastalık yeniden etkinleştirmek için potansiyele sahip latent tüberküloz, en yaygın biçimidir. Yetişkin zebra balığı ve onun doğal patojen Mycobacterium marinum son zamanlarda Tüberküloz hastalığı geniş spektrumu çalışmaya uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır. Önemlisi, spontan gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme gibi edinilmiş bağışıklık yanıtı Mikobakteriyel Enfeksiyon bağlamında bu modelde okudu. Bu makalede, biz yetişkin zebra balığı, nükleik asitler Mikobakteriyel yükler ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı kantitatif PCR ile ölçüm için çıkarım için iç organları koleksiyonu deneysel enfeksiyon için yöntemleri açıklanmaktadır. All-in-house-geliştirilmiş, M. marinum –belirli qPCR tahlil DNA olmayan bölme, Uyuyan veya son zamanlarda ölü mikobakteriler Ayrıca algılarken geleneksel kaplama yöntemleri daha duyarlıdır. DNA ve RNA aynı birey ayıklanır, hastalıklı devlet ve ev sahibi ve patojen gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri incelemek mümkündür. Tüberküloz için yetişkin zebra balığı modeli böylece konak-patojen etkileşimleri çalışmaya son derece uygun, memeli vivo içinde sistemi olarak kendini göstermektedir.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan bir hayvan model Biyomedikal araştırma ve ortak omurgalı biyoloji için kabul edilen bir modeldir. Zebra balığı birçok insan hastalıkları modelleme araştırma alanlarına uyarlanmış ve enfeksiyon ve birçok bakteriyel 3 ve viral enfeksiyonlar4 immünolojik araştırmalar kanser1 ve kalp hastalığı2 arasında değişen bozuklukları , 5. Ayrıca, zebra balığı embriyolar rahim gelişimi gelişim biyolojisi6 ve toksikoloji7,8‘ popüler bir model zebra balığı yaptı.
Araştırma, enfeksiyon biyolojisi, dahil olmak üzere birçok alanda optik şeffaf zebra balığı larva yaygın olarak kullanılır. İlkel makrofajlar algılanan9olduklarında ilk bağışıklık hücreleri 24 saat sonrası döllenme (hpf), içinde görüntülenir. Nötrofil yaklaşık 33 hpf10görünmesini sonraki bağışıklık hücreleri vardır. Zebra balığı larva böylece enfeksiyon erken dönemlerinde ve yokluğunda edinilmiş bağışıklık hücreleri11, doğuştan gelen bağışıklık rolü eğitim için uygulanabilir. Ancak, onun tamamen işlevsel edinilmiş bağışıklık sistemi ile yetişkin zebra balığı ek karmaşıklığı enfeksiyon deneyler için bir katmanı sağlar. T hücreleri çevresinde fertilizasyon123 gün sonrası ve B hücreleri fonksiyonel antikor üretmek mümkün 4 hafta sonrası döllenme13tarafından tespit edilebilir. Yetişkin zebra balığı memeli doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin ana karşılıkları vardır. Balık immune systems ve insanlar arasındaki temel farklılıklar olduğu gibi lenfoid doku anatomisi antikor isotypes de bulunur. İnsanlar beş15var ise sadece üç antikor sınıflar14, zebra balığı vardır. Kemik iliği ve lenf düğümleri yokluğunda, Birincil lenfoid organlar olarak balık böbrek ve timus16 ve dalak, böbrek ve bağırsak ikincil lenfoid organlara17olarak hizmet vermektedir. Hücreleri, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık tam onun cephanelik ile bu farklılıklara rağmen yetişkin zebra balığı bir son derece uygun, kullanımı kolay, memeli konak-patojen etkileşim çalışmaları için modeldir.
Zebra balığı son zamanlarda tüberküloz18,19,20,21,22çalışmaya uygun bir model olarak kurulmuştur. Tüberküloz Mycobacterium tüberküloztarafından neden olduğu hava bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü göre tüberküloz1.7 milyon ölümler 2016 yılında neden oldu ve bir tek patojen dünya çapında23tarafından ölüm önde gelen nedenidir. Fareler24,25, tavşan26 ve insan dışı primatlar27 sınırlamaları her yüz ama tüberküloz araştırmasında en iyi bilinen hayvan modelleri vardır. M. tuberculosis enfeksiyonu insan dışı primat modelin insan hastalık en çok benzeyen, ancak bu modeli kullanan ciddi Etik kaygılar nedeniyle sınırlıdır. Diğer hayvan modellerinde M. tüberküloz hastalığı patoloji etkileyen ana bilgisayar-özgüllük tarafından engel. Tüberküloz modelleme içinde en büyük sorunu insan hastalığında enfeksiyon ve hastalık sonuçları geniş yelpazede olmalı: tüberküloz dokunulmazlık gizli, aktif ve yeniden etkinleştirilen enfeksiyona28 sterilize arasında değişen çok heterojen bir hastalık olduğunu , hangi çoğaltmak ve deneysel model zor olabilir.
Mycobacterium marinum M. tuberculosis ile % 85 amino asit kimlik29~ 3.000 orthologous proteinler ile yakın akrabası olduğunu. M. marinum doğal olarak granülom, tüberküloz, kendi iç organları19,30işaretlerinden üreten zebra balığı bozar. Tüberküloz araştırmalarında kullanılan hayvan modellerin aksine zebra balığı birçok yavrular üretir, yalnızca sınırlı bir alan için ve önemlisi, neurophysiologically az gelişmiş omurgalı tüberküloz modelin kullanılabilir olduğunu. Ayrıca, M. marinum enfeksiyon latent enfeksiyon, aktif hastalık veya hatta sterilizasyon Mikobakteriyel Enfeksiyon yakından spektrum hastalığı sonucu insan tüberküloz19, taklit eden yetişkin zebra balığı neden olur 31 , 32. burada, M. marinum karın boşluğuna enjekte ve Mikobakteriyel yükler ve zebra balığı bağışıklık yanıtlarını ölçmek için kantitatif PCR kullanarak yetişkin zebra balığı deneysel tüberküloz modeli için yöntemleri tarif doku örnekleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada deneysel olarak enfekte yetişkin zebra balığı dokulardan çıkarılan DNA Mikobakteriyel yükler ölçmek için qPCR tabanlı bir uygulama açıklar. Bu uygulama astar 16S-23S rRNA iç kopya etmek spacer sıra40tasarlanmış temel alır. Toplam Mikobakteriyel yükü bir balık örnek olarak kültürlü mikobakteriler bilinen bir dizi arasından çıkarılan ve o bir bakteri genomunu bir kopyasını herhangi bir zamanda sayarsak DNA hazırlanan standart bir eğri kullanarak tahmin edilme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Fin Kültür Vakfı (H.L. tarafından), Tampere tüberküloz Vakfı (H.L., L.-M.V., M.M.H., milletvekili), Finlandiyalı Anti-tüberküloz Derneği (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., temeli desteklenen M.M.H., milletvekili), Sigrid Jusélius Vakfı (milletvekili), Emil Aaltonen Vakfı (M.M.H.), Jane ve fotograf Erkko Vakfı (milletvekili) ve Finlandiya Akademisi (milletvekili). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo ve Jenna Ilomäki teknik yardım kabul vardır. Yazarlar Tampere zebra balığı Laboratuvar Hizmetleri için kabul.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
